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AKAP95 regulates splicing through scaffolding RNAs and RNA processing factoAKAP95通过支架RNA和RNA加工因子调控剪接

2021-01-22 21:30:55 作者：互联网

AKAP95通过支架RNA和RNA加工因子调控剪接

胡静，
Alireza Khodadadi-Jamayran，
毛妙伟，
库沙尼沙阿（
杨振华，
塔拉特·纳西姆（ Md Talat Nasim）
王泽峰＆
郝江

自然通讯 卷 7，产品编号： 13347（2016）引用本文

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9引文
2高度
指标细节

抽象

前mRNA的选择性剪接显着促进了高等生物中基因表达的复杂性，但对剪接位点选择的调控仍未完全了解。我们以前已经证明，与染色质相关的蛋白AKAP95在增强染色质转录方面具有显着的活性。在这项研究中，我们表明AKAP95通过其N末端区域与转录和RNA加工中涉及的许多因素相互作用，包括hnRNP蛋白的选择性基团，并直接调节前mRNA剪接。AKAP95优先与人类转录组中前mRNA的近端内含子区域结合，这种结合需要其锌指结构域。通过选择性地与hnRNP H / F和U蛋白进行协调，AKAP95似乎主要促进了基因组中许多外显子的包含。AKAP95也直接与其自身进行交互。综上所述，我们的结果使AKAP95成为pre-mRNA剪接的主要正调控子，并且可能是转录和剪接调控的整合子。

介绍

真核细胞中的新生信使RNA（mRNA）前体（pre-mRNA）受到广泛的加工，包括剪接以去除内含子，以生成成熟的mRNA。这些处理步骤是通过许多与RNA相互作用的蛋白质和RNA的协同作用来完成的。可变剪接mRNA前体（AS）是后生动物蛋白质组多样性的主要来源，如人多外显子的预mRNA的95％以上的加工成两种或多种mRNA同种型1，2，和AS相关因素的随频率生物体进化沿着复杂3，4。AS调节在多种生物过程中也起着至关重要的作用5，并且AS控制的破坏会导致人类疾病6。

核心剪接信号包括5'剪接位点，3'剪接位点和分支点序列，并且主要被基础剪接机制-剪接体识别。除核心剪接信号外，pre-mRNA的外显子和内含子中还存在许多顺式调控元件，可作为剪接增强子或沉默子7。顺式元件的功能由许多反式剪接因子介导，包括SR和SR相关蛋白，异源核糖核蛋白（hnRNPs）和其他组织特异性RNA结合蛋白8。这些因素通过各种机制激活或抑制剪接位点识别或剪接体组装9，通常以上下文相关的方式进行10。

hnRNP蛋白，包括至少20个名为hnRNP A1到hnRNP U的蛋白，是结构上不同的一组RNA结合蛋白，它们参与RNA加工的许多方面，包括组成性和可变剪接调控11。虽然早期的研究主要是指向剪接hnRNPs的压制作用，但现在很清楚，他们都促进和抑制剪接11，12。某些hnRNP，最明显的是hnRNP F，H1和U，其促进外显子包涵的趋势高于排斥12。。hnRNPs直接与pre-mRNA结合后，可以通过阻断剪接调控因子与剪接位点或剪接增强子的结合，并阻止或促进剪接位点之间的通讯来控制剪接位点的选择。例如，核蛋白A / B和核蛋白F / H已显示出参与同型或异型相互作用，并把不同的内含子区紧密接近，从而“环出”中-之间RNA序列13，14。盒式外显子的包含可以被促进或抑制，这取决于外显子是侧翼还是在环状序列内。hnRNP C显然采用了一种相当相似的策略，该策略还可以通过自相互作用使两个剪接位点紧密靠近，从而根据外显子相对于由其聚集在一起的剪接位点的位置来促进或抑制盒式外显子的包涵。 hnRNP C（参考文献15）。

除了个别的顺式-和反式式作用元件，它越来越清楚的是剪接的基因表达包括转录的集成网络内动态地调节16，17，作为最剪接事件发生cotranscriptionally。几个剪接因子已经显示出与基础转录机制发生物理相互作用，并且转录伸长率可以在调节剪接位点选择中发挥重要作用17。此外，染色质结构还可以通过某些染色质修饰直接募集剪接因子或影响转录延伸率来影响AS 16。。转录和剪接调控的耦合基础的详细机制仍然需要更多的研究。

AKAP95（AKAP8）18是A激酶锚定蛋白（AKAPs）大家族的唯一核成员，该家族与蛋白激酶A结合并时空调节细胞信号转导19。此外，AKAP95是AKAP95家族蛋白的创始成员，还包括HA95（哺乳动物AKAP95旁系同源物）和ZNF326，并且都共享锌指结构域（ZF）20的常见AKAP95亚型。几种不同的功能已经被提出用于AKAP95（参考文献21，22，23），包括染色质凝聚的调解24，25和HDAC的募集至有丝分裂的染色体23。我们以前的工作26已证明AKAP95与SET1 / MLL复合物的DPY30亚基相关，SET1 / MLL复合物是哺乳动物的主要组蛋白H3K4甲基转移酶，并在体外增强了复合物在染色质底物上的甲基化活性。AKAP95强烈刺激染色质报道基因的表达，这种作用需要N末端区域（1-100个残基）和ZFs。我们还显示，AKAP95调节视黄酸介导的小鼠胚胎干（ES）细胞中的基因诱导。然而，AKAP95在调控基因表达中的确切作用仍然难以捉摸。为了进一步了解AKAP95在基因调控中的分子功能，我们采用了无偏见的蛋白质组学方法来鉴定与AKAP95相关的蛋白质。出乎意料的是，我们发现AKAP95主要与许多参与RNA加工的蛋白质相关，包括hnRNP蛋白质。这导致我们进行了进一步的研究，揭示了AKAP95通过调节RNA和RNA加工因子，在调节mRNA前剪接中的功能作用，特别是在促进AS中外显子包涵方面。

结果

AKAP95在其N端结合RNA加工因子

由于AKAP95的N端区域（1–100个残基）高度富含Tyr-Gly（YG）基序（图1a和补充图1a），并且是刺激染色质报道基因表达所必需的26，因此我们认为该区域除DPY30复合物外，可能与基因表达至关重要的因素有关。因此，我们寻求通过免疫亲和纯化稳定表达FLAG-HA标签（FH-）全长人类AKAP95（FH-AKAP95）或FH-AKAP95（101-692）的HEK293细胞系的核提取物来鉴定其结合蛋白。，然后进行质谱分析（图1b和补充表1）。我们发现，主要的AKAP95相关蛋白（质谱蛋白得分> 200）在RNA加工的许多方面都起着重要作用，包括hnRNP M，K，H，F，D和U蛋白，以及DDX5，DDX17， DBC1和RBM14。中间评分（介于40到200之间）的蛋白质包括EWS，PELP1，NHN1，RNA解旋酶A，以及AKAP95家族的其他两个成员HA95和ZNF326。还以相对较低的分数检测到两个SR蛋白SFRS2和SFRS14。我们注意到在FH-AKAP95下拉菜单中未回收到丰富的hnRNP A1，这表明AKAP95与hnRNP蛋白选择性地相互作用。与FH-AKAP95相比，尽管FH-AKAP95（101-692）的表达水平略高，但其下拉序列主要由AKAP95（101-692）及其降解形式组成（图1b）。）。除了hnRNPs M，H和F得分低得多以外，没有其他与AKAP95相关的蛋白在AKAP95的下拉菜单中被回收（101-692；图1c和补充表1），表明该蛋白的重要作用。 N末端区域（1–100个残基），用于结合RNA加工因子。

图1：AKAP95在其N端与许多参与转录和RNA加工的蛋白质相关。

（a）AKAP95上的域示意图。有关序列和注释，请参见补充图1a。（b）从亲本（对照）和293细胞系中稳定表达FLAG-HA标记（FH-）AKAP95或AKAP95（101-692）的免疫亲和纯化后，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分离的蛋白质的考马斯蓝染色。指出了通过质谱从指定的细胞系中特异性鉴定出的主要蛋白质。泳道左侧的线表示质谱的凝胶切除位置。粗体蛋白质的蛋白质得分超过200。（c）绘制与FH-AKAP95或FH-AKAP95共免疫沉淀的鉴定的hnRNP蛋白质的质谱蛋白质得分（101-692）。（d通过对照（正常兔IgG）或抗AKAP95抗体免疫沉淀HeLa细胞核提取物后，对内源性AKAP95相关蛋白进行免疫印迹分析。（e）通过直链珠（MBP↓）对来自表达MBP或MBP的293细胞的裂解物的溶胞产物的免疫沉淀进行免疫印迹分析，所述MBP或MBP与AKAP95野生型或突变体融合。hnRNPs的抗体被用于印迹，膜也被丽春红S染色以显示一般负载以及MBP或MBP融合蛋白的可比沉淀。（f）通过抗-FLAG抗体缀合的树脂（FLAG↓）对来自表达FH标签的AKAP95野生型或突变体的293细胞的裂解物进行免疫沉淀的免疫印迹分析，如所示。hnRNP蛋白或FLAG表位的抗体被用于印迹。（g）AKAP95与hnRNP F的直接相互作用，如纯化的F-AKAP95或F-AKAP95（101-692）与仍与Ni树脂结合的纯化的His-hnRNP F的体外结合测定的免疫印迹分析所示。还显示了F-AKAP95和F-AKAP95（101-692）的输入（英寸）。（ħ）与hnRNPs M和H1 AKAP95的直接相互作用，如由的免疫印迹分析在体外对纯化的F-AKAP95或F-AKAP95（101-692）结合测定法以纯化GST（泳道3和4），GST-仍然与谷胱甘肽树脂结合的hnRNP M（泳道5和6）和GST-hnRNP H1（泳道7和8）。还显示了F-AKAP95和F-AKAP95（101-692）的输入（通道1和2）。

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通过与HeLa细胞核提取物中的AKAP95进行共免疫沉淀，证实了其中一些蛋白质的内源性结合（图1d）。尽管质谱分析未发现RNA聚合酶II（Pol II），但我们的免疫印迹分析表明AKAP95与在其C端结构域的5或2丝氨酸上未磷酸化或磷酸化的Pol II关联，尽管丝氨酸2的关联-磷酸化的Pol II由于总体信号较低而不确定（图1d）。AKAP95与这些蛋白质的缔合不是由RNA介导的，因为用RNA酶A有效处理核提取物对共免疫沉淀的效率影响很小（补充图1b，c）。

与质谱分析一致，我们通过单独的下拉分析进行的免疫印迹分析还表明，AKAP95（101-692）不能有效结合hnRNP M，F或H1（图1e）。但是，AKAP95 ZF C-S突变体（两个锌指均具有Cys到Ser突变，补充图1a）26与野生型AKAP95（图1e）一样有效地与这些hnRNP结合。重要的是，AKF95的N端区域足以介导与这些hnRNP的结合，如FH-AKAP95（1-210）和FH-AKAP95（1-340）对这些蛋白的有效免疫共沉淀所表明的那样（1-340；图1f）。由于AKAP95（1–100）在细胞中的表达或稳定性较差，因此无法进行测试。此外，我们证明了纯化的hnRNPs F，H1和M与AKAP95直接结合，但与AKAP95没有直接结合（101-692；图1g，h）。此外，在体外，AKAP95与hnRNP M的结合似乎比H1更强（图1g，h），这表明AKAP95与hnRNP之间的结合亲和力不同。这些结果表明，AKAP95的N端区域关键性地介导了与包括hnRNPs选择性基团在内的RNA加工因子的结合，而其ZFs对于与这些因子的结合是必不可少的。

AKAP95直接调节小基因前mRNA的剪接

许多RNA加工因子与AKAP95的物理关联表明AKAP95在RNA加工中具有潜在功能，例如前RNA剪接的调控。因此，我们着手从一个小基因剪接系统（图2a）开始测试这个假设，该系统允许通过双重报告基因检测27方便地剪接读出。我们发现，小基因在人类293细胞中的剪接效率通过AKAP95以及AKAP95家族的其他两个成员HA95和ZNF326的过表达而得到增强（图2b）。相反，在短发夹RNA（shRNA）介导的小鼠NIH3T3细胞中的Akap95敲除（KD）后，小基因的剪接效率较低，如双重报告基因法和基于PCR的检测所证实的那样（图2c）。同样，AKAP95 KD通过对AKAP95的3'-非翻译区（3'UTR）特异或对AKAP95（Smart-pool siRNA，SMP ）具有混合特异性的小干扰RNA（siRNA）降低了小基因的剪接效率。）在人的293细胞中（图2d）。重要的是，剪接是通过在内源水平附近表达的野生型AKAP95挽救的，但不能以与野生型相似的水平表达的AKAP95（101-692）或AKAP95 ZF C-S突变体得以挽救（图2d）。这些结果表明，在细胞中进行有效的小基因剪接需要AKAP95，其N末端100个残基和ZF对该调控至关重要。

图2：高效小基因剪接直接需要AKAP95。

（a）小基因剪接报告物的图。“ xxx”代表插入内含子的三个终止密码子。箭头代表用于c的PCR引物。（b）将与剪接报道分子和所示质粒共转染的293细胞进行双报道分子测定。hnRNP G和Trα2β，分别是已知的小基因剪接的负和正调节子，分别为27，作为对照。绘制了来自四个独立转染的平均值±sd。在载体转染和指示的样品之间，* P <0.01，** P <0.001。（c在稳定感染对照或Akap95 shRNA后，将剪接报道基因转染到NIH3T3细胞中。通过两种方法确定剪接，包括双报告基因分析（上图）和基于PCR的分析（下图）。绘制了来自三个生物学重复的平均值±sd。**两个样本之间的P <0.001。（d）用指示的siRNA和质粒共转染的293细胞用指示的抗体进行免疫印迹（顶部）和双重报告基因测定（底部）。NT是非靶向siRNA。GL2 siRNA靶向荧光素酶RNA。绘制了来自三个独立转染的平均值±sd。*指示样品与样品1或4之间的P <0.01。样品1与样品4之间的P > 0.05。（e）使用两个不同批次的HeLa核提取物进行体外剪接测定，其中批次1（左凝胶）的浓度要高得多，因此比批次2（右凝胶）的活性更高。第2批核提取物来自HeLa细胞，其中AKAP95被shRNA稳定地敲低。当用“ +”指示时，HeLa核提取物被抗体消耗了AKAP95。如所示添加两种不同剂量的纯化的重组AKAP95或其突变体。免疫印迹（顶部）指示外源野生型或突变型AKAP95的水平。根据条带强度的定量计算拼接产品在总产品中的百分比（拼接的百分比），并绘制为三个独立的拼接分析的平均值±sd（下图）。* P <0.01，** P指示的样品和任何样品2、5-8之间的<0.001。

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接下来，我们询问AKAP95是否直接参与无细胞剪接反应中的剪接调控。首先，我们证明了我们的HeLa细胞核提取物可以以对盐浓度和热量敏感的方式有效地剪接小基因pre-mRNA（补充图2a），与已建立的体外剪接系统28一致。还对衍生的PCR产物进行序列验证以代表未剪接和剪接的物种。我们显示抗体介导的AKAP95耗竭显着减少了小基因转录本的剪接（图2e，左凝胶）。为了实现更清洁的AKAP95耗竭，我们使用了被shRNA稳定敲除AKAP95的HeLa细胞，还使用了经过改进的方案以低得多的蛋白质浓度从这些细胞中提取核提取物。来自该核提取物的抗体进一步消耗AKAP95减少了前mRNA剪接（图2e，比较右侧凝胶的泳道1和2）。重要的是，以相似的水平添加两种不同剂量的纯化野生型AKAP95，但不添加AKAP95（101-692）或AKAP95 ZF C-S突变体（补充图2b），在该无细胞系统中几乎完全恢复了剪接（图2e）。这些结果表明，AKAP95直接调节小基因前mRNA剪接，并且其N端区域和ZF都是直接调节所必需的。

AKAP95直接调节的可变剪接FAM126A

接下来，我们寻求内源性AKAP95靶标进行剪接调控。考虑到AKAP95和hnRNP F的直接相互作用，我们研究了AKAP95 KD对已被hnRNP F调控的剪接事件的影响，包括FAM126A转录本外显子11的AS （FAM126A-006 ENST00000409923）12。与hnRNP F KD的作用相比（图3a），在不同的人细胞系中由特异性shRNA或siRNA介导的AKAP95 KD始终导致外显子11在FAM126A转录物中的跳跃（减少包涵）增加（图3a）。重要的是，AKAP95 KD不会在RNA或蛋白质水平上影响hnRNP的表达（补充图3a，b）。此外，在小鼠ES细胞中由两种不同的shRNA介导的Akap95 KD也损害了小鼠Fam126a中外显子10（人外显子11的相应外显子）的包被（图3a，右，补充图3a，b），表明存在AKAP95在调节FAM126A AS中的保守作用。

图3：AKAP95直接调节FAM126A的AS 。

（a）使用指示的shRNAs（用于293和ES细胞）或siRNAs（用于H1299）在人293和H1299细胞以及小鼠ES细胞中在AKAP95 KD之后跳过FAM126A外显子11的PCR测定。将Scramble shRNA用作对照shRNA，将靶向荧光素酶RNA的GL2 siRNA用作对照siRNA。在通过ImageJ程序对条带强度进行定量之后，计算了代表总外显子中外显子11跳过的转录物的PCR产物的百分比，并在y轴上显示为“跳过的百分比” 。对于所有细胞，绘制了来自三个生物学重复的平均值±sd。* P <0.01，** P <0.001在所示样品和相应的对照样品之间。（bFH-AKAP95或所示突变体的表达是由多西环素在稳定的Flp-In T-REx 293细胞系中诱导的。对照是亲本的Flp-In T-REx 293细胞。表达水平通过蛋白质印迹对AKAP95显示（左）。在紫外线交联后，在这些细胞系中进行了抗FLAG RIP分析，然后在FAM126A基因座（该图最底部的示意图）中使用一系列引物（曲线上的点表示）进行qPCR分析。补充图3d显示了RIP测定的另一种生物学重复。（c）在紫外线交联后，在293细胞中进行了使用对照品（正常兔IgG）或抗AKAP95抗体的RIP分析，然后通过与b中相同的系列引物进行qPCR在FAM126A所在地。补充图3e中显示了另外两个独立的生物学重复。（d）将293T细胞用空载体（对照）或FH-hnRNP F质粒转染，以使用与补充图3g中所圈定的质粒剂量表达亚内源水平的FH-hnRNPF 。在紫外线交联后进行抗FLAG RIP分析，然后在FAM126A进行qPCR 。补充图3f显示了另外两个独立的生物学重复。

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为了确定AKAP95是否直接调节FAM126A剪接，我们在甲醛或紫外线介导的细胞交联后进行RNA免疫沉淀（RIP）分析。甲醛往往提供比紫外线更高的交联效率，但是它也使蛋白质与相互作用的蛋白质交联，而紫外线交联仅对直接的RNA-蛋白质接触有效。为了在我们较早的RIP分析中获得强大的RIP信号，我们诱导了293细胞中FH-AKAP95，FH-AKAP95（101-692）或FH-AKAP95 ZF C-S的表达达到高水平（补充图3c）。），并进行甲醛交联。我们的RIP分析包括广泛的DNAse处理，然后将纯化的RNA反转录为DNA，用于定量PCR（qPCR）反应。此外，当从反应中省略反转录酶SS III时，qPCR信号被消除（补充图3c），表明RIP信号确实来自RNA。

我们的RIP-qPCR测定表明，FH-AKAP95结合到三个主要位点周围的AKAP95调节的外显子11的区域FAM126A（补充图3c）。前两个位点位于外显子10和11交界处的内含子区域。最后一个是在第12外显子，其中包含3'UTR。这些RIP信号是FH-AKAP95特有的，因为阴性对照细胞中基本上不存在它们（补充图3c）。FH-AKAP95（101-692）的RNA结合与FH-AKAP95的RNA结合非常相似（或在某些区域有所降低），但FH-AKAP95 ZF C-S在所有三个主要位点的RNA结合均存在缺陷表达水平（补充图3c）。这些结果表明，ZFs对AKAP95与FAM126A pre-mRNA的结合至关重要，但对N末端1-100个残基没有影响。

然后，我们在紫外线交联后进行了RIP分析，以检测在允许FH-AKAP95和突变体达到内源水平的可比表达的条件下的直接RNA-蛋白质结合（图3b和补充图3d）。尽管总体信号强度较低，但在这些条件下的RIP结果（图3b和补充图3d）与我们先前对过表达FH-AKAP95的甲醛交联RIP分析的结果高度相似（补充图3c）。此外，我们还对紫外线交联后的内源性AKAP95进行了RIP分析（图3c和补充图3e）），并且与甲醛交联后的谱图高度相似，进一步证明AKAP95直接与FAM126A pre-mRNA结合。我们还表明，Akap95在小鼠ES细胞结合到邻近的Akap95调节的外显子10很大程度上类似于区域Fam126a（补充图3h），表明一个保守AKAP95用于调节外显子内含结合模式FAM126A。

在表达亚内源水平的FH-hnRNP F的293细胞进行紫外线交联后，我们还确定了hnRNP F与FAM126A pre-mRNA的直接结合（补充图3g），因为我们的抗hnRNP F抗体不能有效发挥作用与内源性hnRNP F的直接结合一致（与hnRNP F和AKAP95之间的直接结合（图1g）一致），还发现FH-hnRNP F与AKAP95相同的内含子位点直接结合（图3d和补充图3f））。因此，这些结果通过相互作用的AKAP95和hnRNP F蛋白建立了FAM126A外显子11包含的直接和联合调控。

AKAP95与细胞前mRNA的内含子区域结合

然后，我们通过对293交联的甲醛中由于其坚固性而从抗AKAP95 RIP分析中富集的RNA进行深度测序分析，确定了内源性AKAP95与人类转录组的结合。通过RIP-seq分析鉴定出内源性AKAP95的广泛结合位点，而AKAP95 KD之后的RIP信号减少则支持AKAP95 RIP信号的特异性（图4f和补充图3b）。对RIP-seq结果的分析表明，AKAP95主要结合内含子区域（图4a，f和补充图4e，f），特别是在外显子-内含子连接处（500 nt以内）紧密结合（图4a， d）。尽管AKAP95还与5'和3'UTR以及外显子结合（图4a，b），但这些区域的结合效率比内含子区域（图4c）低，因为这些区域比内含子区域丰富得多。总RNA输入中的内含子区域。AKAP95倾向于与富含AU的基序结合，尽管几种不同的基序与AKAP95相关（图4e）。

图4：AKAP95优先结合细胞前mRNA的内含子。

（a）根据MACS峰计数计算的不同种类的基因区域内的内源性AKAP95结合位点数目的分布。颜色图例适用于一个- ç。结果在一- ë是从在293个细胞中的抗AKAP95 RIP测定。（b）在不同基因区域的每100万个核苷酸中AKAP95结合位点的数目。（c）AKAP95对不同类别基因区的结合效率，计算方法为抗AKAP95 RIP覆盖率与相应基因区中输入RNA覆盖率之比。（d）跨复合内含子（左）或外显子（右）的AKAP95结合图。既显示了内源性AKAP95结合图谱（RIP，顶部），也显示了相应的输入RNA图谱（Input，底部）。对于底部的图，实线，内含子；打开盒子，外显子。右侧分析中不包含含UTR的外显子。（e）转录组中由AKAP95结合的最丰富的序列基序。（f）代表性RIP配置文件。蓝色是稳定表达FH标签的AKAP95野生型或突变体的亲本293细胞（对照）或293细胞的抗FLAG RIP-seq图谱，如图所示。红色为稳定表达AKAP95 microRNA（miR＃12，显示为AKAP95 KD）的亲本293细胞（对照）或293细胞的抗AKAP95 RIP-seq图谱。黑色为来自相应细胞的抗AKAP95 RIP-seq的总输入RNA的测序图谱。每个基因的所有图谱都有相同的y轴比例，因此可以直接比较。基因图上的箭头指示基因转录的方向。

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为了了解域对转录组结合的贡献，我们还确定了稳定表达的野生型和突变型AKAP95的RNA结合谱。过度表达的野生型FH-AKAP95的RNA结合谱与内源性AKAP95的RNA谱总体相似（图4f和补充图4a-c，e，f），表明其过表达不会显着改变转录组。捆绑。RIP-seq结果还证实了AKAP95与FAM126A调控外显子11附近的内含子区域的结合（补充图4e）。与野生型相比，AKAP95（101–692）突变体在许多转录本上表现出相似的结合模式，但信号水平未受影响或未降低，但AKAP95 ZFCS突变体显示出与转录物的结合显着降低（图4f和补充图4e，f）。虽然这些结果表明N末端区域有助于AKAP95的RNA结合，但它们清楚地表明AKAP95的锌指在转录组结合中的关键作用。

我们还对细胞进行紫外线交联后对过表达的野生型或突变型AKAP95和内源性AKAP95进行了RIP分析，并通过qPCR在基于甲醛交联的几个位点上确定了它们在高水平上被AKAP95结合的多个位点的结合RIP-seq结果。尽管大多数区域的紫外线交联产生的信号总体较低，但我们从紫外线和甲醛交联方法获得的结果与这些位置中的大多数极为相似（补充图4d）。这些结果表明，尽管间接结合也可能对RIP信号有贡献，但我们的RIP测定法反映了AKAP95与前mRNA的直接结合。

AKAP95主要促进全球外显子的包容

为了评估AKAP95对AS的整体影响，我们在人的293细胞和小鼠ES细胞中耗竭了AKAP95，并进行了RNA-seq和DEXseq分析29以鉴定细胞mRNA中不同的外显子用法。DEXseq分析通过考虑生物学差异29提供了对错误发现的可靠控制。AKAP95 KD导致293（图5a，b和补充数据1）和ES细胞（补充图5a，b和补充数据1）的增加导致外显子使用减少的事件远多于增加事件，这表明AKAP95通过促进外显子包涵的偏好。我们验证了某些外显子用法的善意性通过基于PCR的检测发现外显子包含或跳过事件（补充图5d）。

图5：AKAP95的功能主要是促进外显子包涵。

（a）在293细胞中，其标准化用法受到显着影响（错误发现率或红色和黄色的Padj <0.01，红色超过2倍变化）的外显子的火山图（Padj> 0.01，蓝色）。倍数变化是AKAP95 KD中标准化外显子水平与对照细胞中标准化外显子水平的比率。有关基因列表，请参见补充数据1。（b）饼图显示了293细胞中AKAP95 KD的标准化用法显着（Padj <0.01）减少（蓝色）或增强（红色）两倍以上的外显子数量。（c）在293细胞中表达受到显着影响（红色和黄色的Padj <0.01，红色超过2的倍数变化）或不受影响（Padj> 0.01，蓝色）的基因的火山图。倍数变化是AKAP95 KD中标准化外显子水平与对照细胞中标准化外显子水平的比率。（d）维恩图显示含有显着影响（减少和增强）两倍以上的外显子的基因与在293细胞中在AKAP95 KD上表达显着改变的基因之间的微不足道的重叠。双尾P值通过计算χ 2测试用耶茨校正。（e）维恩图显示在AKAP95 KD上含有显着（Padj <0.01）显着（Padj <0.01）减少（左）或增强（两倍）的外显子的基因与293细胞内含子区域转录被AKAP95结合的基因之间的显着重叠。双尾P值通过计算χ 2测试用耶茨校正。（fAKAP95的功能和物理靶基因的基因本体分析。蓝条和红条表示在293细胞中AKAP95 KD上含有显着（Padj <0.01）影响的外显子两倍的基因，基于2189个下调了外显子的DAVID ID和657个上调了外显子的DAVID ID。黑条表示其转录物在内含子区域受AKAP95结合的基因，基于293细胞中抗AKAP95 RIP分析的2,000个内含子结合的MACS峰（具有最高峰得分）对应的1381个DAVID ID。浅蓝色阴影的基因功能用于染色质和转录调控，粉红色阴影的基因功能用于RNA结合和加工。

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由于某些基因表达的减少，对减少外显子使用量的影响不仅仅是技术偏见，因为（1）DEXseq将每个外显子信号水平相对于基因29中的总外显子信号水平进行标准化，（2）绝大多数显着影响外显子使用的基因在293细胞中的表达不受AKAP95 KD的显着影响（图5c，d），（3）我们的PCR数据证实了跳过或包含特定外显子而不是基因表达的影响（补充图5d）和（4），虽然在小鼠ES细胞中Akap95 KD后相似数目的基因的表达上调或下调（补充图5c），但外显子的使用却多于减少（图5c）。补充图5a，b）。

为了确定替代外显子的使用是否直接影响AKAP95活性，我们将AKAP95物理靶标（基于AKAP95 RIP-seq）与其功能性靶标（基于mRNA-seq）进行了比较。在其内含子上结合有AKAP95的基因与在AKAP95 KD上显示外显子使用发生显着变化（降低或增加）的基因显着重叠（图5e），这表明许多差异性外显子使用事件是AKAP95活性的直接影响。在RNA。

为了确定AKAP95靶标所涉及的生物学途径，我们对AKAP95的功能靶标和物理靶标进行了基因本体分析。我们的研究结果表明，在293细胞（图5f）和小鼠ES细胞（补充图5e）以及AKES95 KD中，AKAP95 KD的外显子用法存在差异的基因中，染色质/转录调节因子和RNA加工因子显着富集。带有AKAP95的基因与内含子结合（图5f，黑色柱）。这些结果表明，AKAP95可以通过直接和间接控制染色质，转录和RNA加工来调节全局基因表达（补充图5f）。

AKAP95和选定的hnRNP共同调节替代剪接

为了进一步了解AKAP95与不同的hnRNP蛋白的功能关系，我们还检查了AKAP95 KD对先前显示受各种hnRNP耗尽影响的外显子包涵体的影响12。我们发现，虽然AKAP95 KD不会影响hnRNPs的表达（补充图3a，b），但它会以与hnRNP F，U和H1耗尽相同的方向影响外显子使用，但对A1却没有影响（图6a）。）。这与AKAP95与hnRNP H / F和U，而非A1的物理相互作用一致（图1b和补充表1）。重要的是，我们表明AKAP95与内含子结合后立即位于受调控外显子的侧面（图6b和图6b）。补充图6a），并且结合区域经常与hnRNP H / F和U结合的区域重叠。有趣的是，尽管hnRNP A1和AKAP95在某些基因的直接内含子内也有重叠的结合区域（补充图6a），这些蛋白质通常对附近外显子的包涵有不同的影响（图6a）。这些结果进一步加强了我们通过与hnRNP的选择性协调来直接控制AKAP95控制外显子包涵的模型。

图6：AKAP95与hnRNP选择性地协同调节AS。

（a）293细胞中AKAP95 KD对外显子AS的影响，先前显示在表12中所示hnRNP耗尽后被略过（sk）或包含更多（in）。将Scramble shRNA表达细胞用作对照（“ C”），而表达AKAP95 shRNA的细胞称为KD。如图3a所示，计算y轴上的“跳过百分比” 。将来自生物学重复的平均值±sd作图。除G2AD和PICALM外，所有这些基因的对照和KD之间P <0.05 。（b）RNA结合在侧翼调节外显子（由红色圆圈标记）RNA区的外源性和内源性AKAP95（分别为蓝色和红色）的型材一个。底部显示的是hnRNP蛋白的结合区，取自http://rnabind.ucsd.edu/。补充图6a中显示了α中其他基因的结合概况。

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AKAP95与自身相互作用

动作的环出模型已经提出了用于通过核蛋白A / B和核蛋白F / H蛋白剪接调节通过与其自身或不同的核糖核蛋白蛋白质相互作用13，14。我们试图评估AKAP95是否可能以类似的方式起作用。我们发现AKAP95可以有效地与自身相互作用，因为FH-AKAP95可以通过与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合的共转染AKAP95进行共沉淀，而不能单独通过MBP进行共沉淀（图7a）。我们还发现AKAP95直接与其自身相互作用，因为纯化的AKAP95-MBP而不是MBP可以有效地结合纯化的F-AKAP95（图7b）。而AKAP95（101–692）和AKAP95 ZF C-S由于能够与AKAP95结合，AKAP95（211–692）与AKAP95的结合能力显着降低。此外，AKAP95（1-210）足以介导AKAP95结合（图7a）。因此，N端区域1-210，尤其是101-210，可能在AKAP95自相互作用中起重要作用。这些数据提供了这样的可能性，即通过与RNA内含子序列的每个末端结合和自我相互作用，AKAP95可以帮助使内含子的两端接近，从而促进剪接位点的通信和内含子的定义（补充图6b）。。

图7：AKAP95与自身交互。

（a）AKAP95通过其N端区域自相互作用。293T细胞与MBP标签的AKAP95或AKAP95（101–692）和FH标签的AKAP95或所示的突变体共转染。未融合的MBP（'M'）用作对照。MBP及其融合蛋白被直链淀粉树脂（MBP↓）沉淀，并通过免疫印迹检测输入和结合的蛋白。（b）在体外结合试验中，将与直链淀粉树脂结合的纯化的MBP或AKAP95-MBP融合蛋白（MBP↓）与纯化的FLAG-AKAP95进行孵育，并通过免疫印迹检测输入的和与树脂结合的蛋白。

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讨论区

尽管前mRNA剪接是遗传信息流中的主要步骤，但已显示只有少数剪接调控因子负责控制细胞中大量的AS事件8。最近的研究20，30个已经确定了数百种RNA结合蛋白可能潜在调节RNA生物学的许多方面，包括拼接，但其中许多人的功能作用尚未特征RNA代谢。在这些鉴定出的RNA结合蛋白中，AKAP95家族的所有三个成员都具有共同的ZF。除了我们先前工作中显示的在转录共激活中的作用26，这项研究的几条功能性证据（总结如下）共同支持AKAP95在前mRNA剪接调控中的主要积极作用。（1）AKAP95的过表达增强了小基因报道基因的剪接，而其耗竭减少了小基因报道的剪接。（2）AKAP95是在体外有效剪接预转录RNA所必需的。（3）人293细胞和小鼠ES细胞中AKAP95的耗尽主要导致外显子包涵事件减少。功能证据完全符合我们的生物化学结果，即AKAP95结合许多RNA加工因子，包括hnRNP的选择性基团，也直接结合到对内含子有强烈偏好的pre-mRNA上。AKAP95的在近端内含子区，其富含许多内含子剪接的调控元件的主要位置31，32，33，是与它在调节剪接位点的选择作用是一致的。

我们推测，AKAP95可能有助于通过两个RNA结合和蛋白质-蛋白质相互作用（剪接位点通信补充图6b），类似于用于核蛋白A1和H / F所提出的机制13，14。此类相互作用可能涉及AKAP95与选择性hnRNP和/或自身。该模型得到至少一些检查的目标转录本（例如FAM126A和WDR85）的功能和生化数据的支持）（AKAP95和hnRNP H / F），其中AKAP95结合内含子的两个末端，紧接受调控的外显子。该模型对其他AKAP95靶标的普遍性有待进一步研究，包括AKAP95结合序列的高分辨率定位和更详细的生化解剖。

我们的结果表明，AKAP95家族的其他两个成员HA95和ZNF326可以与AKAP95物理结合（图1b和补充表1），并且还调节RNA剪接（图2b），但是AKAP95显然具有非冗余作用如其耗尽后对拼接的影响所反映。了解这些AKAP95家族成员是否通过相似或不同的机制调节RNA加工，以及细胞如何调节其在RNA加工中的不同用途和/或功能，将是很有趣的。ZNF326已被证明可以通过促进转录伸长率来调节AS 34，从而在较弱的剪接位点被新兴的较强剪接位点竞争之前减少了对较弱的剪接位点识别的时间窗口。有两线证据表明，AKAP95可能不会通过针对ZNF326提出的相同机制来调控剪接。（1）我们的体外剪接结果表明，即使AKAP95与转录脱钩，它也能够刺激剪接。（2）与在AKAP95 KD上包含外显子相比，外显子跳跃更可取，这与ZNF326 KD上优选的外显子包含相反（参考资料34）。但是，我们的结果并未排除AKAP95可能通过转录延长对外显子包涵体的动力学作用而调节细胞中共转录剪接的可能性，并产生不同的结果。

我们先前的26和这项研究已经建立了AKAP95与转录和pre-RNA剪接的物理和功能连接。AKAP95的N末端（1-100）和ZF是其在转录共激活和剪接调控中的活性所必需的。重要的是，N末端区域（1–100）的截短不太可能影响AKAP95的整体结构完整性，因为缺少该末端或更广泛的N末端区域的突变体在（i）介导染色质凝聚35，（ii ）与染色质26上的报告子启动子结合，以及（iii）与转录组中的许多区域结合。相反，N端区域在介导与许多hnRNP蛋白的结合中是必需的，并且足够（图1f）。除了RNA聚合酶II，许多其他AKAP95 N末端相关蛋白包括PELP1（参考文献36，37），RNA解旋酶A（参考文献38，39，40），EWS（参考文献41），DDX5和DDX17（参考文献。42）和RBM14（CoAA；参考资料43）都已被证明与转录激活有关。因此，N末端区域在转录共激活和剪接调控中的作用最有可能是通过与两个过程中的重要因素结合而介导的。除了蛋白质相互作用外，富含N端YG的区域也可能有助于AKAP95的RNA结合能力，因为其缺失会适度削弱某些前mRNA区域的结合。这与以下观察结果一致：YG / RG基序经常与许多RNA结合蛋白中的RNA结合域结合使用20。另一方面，ZF对于AKAP95通过与前mRNA结合来调节RNA加工至关重要，但是它们在转录共激活中的作用仍然难以捉摸。值得注意的是，AKAP95中的锌指亚型是一个新的RNA结合域，有人提出20，但以前并未通过实验证明。AKAP95的锌指在介导染色体浓缩35中很重要，可能直接或间接促进AKAP95与染色质的缔合。由于转录和剪接之间的交流都是双向的16，AKAP95仍然有可能通过直接影响RNA结合和剪接来调节转录。

RNA结合蛋白的交叉调控和剪接级联中的信号放大已作为剪接网络的一般特征出现，并且可用于稳定细胞状态内的剪接模式或扩展和增强剪接网络44。AKAP95直接调节许多RNA的加工，其蛋白质产物参与RNA加工和染色质或转录调控（图5f和补充图5e）。与直接hnRNPs-AKAP95相互作用一致，许多hnRNP蛋白也已知会影响编码RNA加工因子12的RNA的剪接。因此，AKAP95可能与不同的hnRNP协同作用，以创建基因表达和功能的调控级联（补充图5f）。

除了转录和剪接调控外，AKAP95还可以调控RNA加工中的其他步骤，因为它与前mRNA的UTR和许多在RNA加工中起多种作用的因子结合。确实，AKAP95与LDHA mRNA的3'UTR以及蛋白激酶A的调节亚基结合，并调节该mRNA 22的稳定性。我们在AKAP95免疫沉淀物中发现的NHN1（ZC3H18）和ZCCHC8也与帽结合复合物45，靶向核外泌体的复合物46和催化前剪接体复合物47相关，并涉及RNA加工的多个步骤和新陈代谢。

在突变FAM126A已因果联系hypomyelination和先天性白内障，由于其前mRNA剪接的失调及其蛋白质产物随之而来的不足，hyccin 48，49。包含受AKAP95和hnRNP F调节的FAM126A外显子11会导致C末端截短的hyccin蛋白（419个残基与521个残基相比）。目前尚不清楚这种截短是否以及如何影响蛋白质功能以及与疾病的潜在联系，但它显示了AKAP95如何通过剪接调控来调控人类病理。AKAP95也参与了头部生长和自闭症的调节50，并发现与某些细胞周期蛋白基因一起在直肠癌中显着过表达51。后者与GO术语“细胞周期”在AKAP95结合或调控的靶标中的富集相一致（图5f和补充图5e），还与hnRNPs（许多在物理上和功能上与AKAP95）直接靶向大量与癌症相关的基因12。

方法

蛋白质与AKAP95相互作用的表征

FH-AKAP95和FH-AKAP95（101–692）细胞系是通过将plp-In-293细胞（f293细胞，Invitrogen）与pOG44质粒和FH-AKAP95-pcDNA5或FH-AKAP95（ 101–692）-pcDNA5质粒，然后用潮霉素B选择稳定的克隆。通过改良的Dignam程序52从这些细胞系中获得核提取物，并与抗FLAG M2琼脂糖珠（Sigma）在BC300（50 mM Tris（pH 7.4），300 mM KCl，20％甘油，0.2 mM EDTA）中温育。 0.1％NP40在4°C下放置6小时，然后分别用BC300、0.1％NP40和BC100、0.1％NP40充分洗涤。结合的蛋白用0.4 mg ml -1洗脱BC100中含有0.1％NP40的FLAG肽（Sigma），在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离，并通过考马斯染色进行可视化。将整个凝胶泳道切成指定的条带，并对蛋白质进行基质辅助激光解吸/电离质谱分析。常见的背景蛋白（例如，角蛋白和微管蛋白）和在对照细胞提取物中的下拉列表中发现的蛋白均不包括在相互作用蛋白列表中。在0.1％NP40的BC300的HeLa细胞核提取物中进行内源性蛋白质缔合的共免疫沉淀。过度表达的AKAP95（及其突变体）与内源蛋白的共免疫沉淀是通过将指示的构建体转染到293T细胞中，然后在BC300、0.1％NP40的细胞裂解物中用抗FLAG M2琼脂糖珠进行IP进行的。26。简而言之，将带有标志标签的AKAP95，AKAP95（101–692）或AKAP95 ZF C-S cDNA插入pFastBac1载体（Invitrogen），并根据Bac-to-Bac杆状病毒表达系统（Invitrogen）协议生成杆状病毒。将感染杆状病毒的sf9细胞在BC500中用0.05％NP40、1 mM DTT和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）裂解。将裂解物与抗FLAG M2琼脂糖珠（Sigma）孵育，并用裂解缓冲液充分洗涤珠，然后在含0.05％NP40的BC100中进一步洗涤。用0.4 mg ml -1洗脱结合的蛋白质具有0.05％NP40的BC100中的FLAG肽（Sigma）。使用Ni-NTA树脂（GE Healthcare）从表达His-hnRNP F的杆状病毒感染的sf9细胞（通常由加拿大舍布鲁克大学的Benoit Chabot提供）中纯化带有His标记的hnRNPF。从293细胞cDNA扩增hnRNPs M和H1 cDNA，并将其克隆到pGEX-4T-1载体（GE Healthcare）中。0.5 mM异丙基β- D诱导谷胱甘肽S-转移酶（GST），GST-hnRNP M和GST-hnRNP H1在BL21（DE3）大肠杆菌中表达-thiogalactopyranoside在22°C下放置5 h，然后使用谷胱甘肽琼脂糖4B树脂（GE Healthcare）纯化，无需洗脱。与树脂结合的hnRNP蛋白与BC200中0.1％NP40的纯化F-AKAP95和F-AKAP95（101-692）蛋白一起用于结合测定。为了直接进行AKAP95自身相互作用，使用直链淀粉树脂（New England BioLabs，E8021S）从感染了相应杆状病毒的sf9细胞中纯化MBP和AKAP95-MBP融合蛋白，并在充分洗涤后仍与树脂结合。与树脂结合的蛋白质用于与纯化的F-AKAP95蛋白质在BC200、0.05％NP40中的结合测定中。

抗体

抗体可商购获得。来自圣克鲁斯生物技术公司：抗AKAP95（sc-10766，1：500）；抗DDX5（sc-32858，1：500）; 抗hnRNP M（sc-20002，1：500）; hnRNP F（sc-10045，1：500）; 反His（sc-803，1：500）; 和抗RNA Pol II（sc-899，1：500）。其他：抗hnRNP A1（Novus Biologicals，NB100–672，1：2,000），抗Pol II（Covance，MPY-127R用于克隆8WG16，H14和H5，1：500），抗hnRNP H（乙基实验室），A300–511A，1：2,000）；DDX17（Bethyl Laboratories，A300-509A，1：2,000）；抗HA（Abcam，ab9110，1：1,000）; 抗GAPDH（Chemicon，MAB374，1：5,000）; 抗FLAG（Sigma，A8592，1：1,000）; 抗FLAG（Sigma，A2220，M2磁珠）; 和抗MBP（New England BioLabs，E8032S，1：5,000）。

剪接报告基因分析

在pTN24报告质粒27上进行了双重报告剪接分析。简而言之，使用Lipofectamine 2000试剂（Life Technologies）将细胞用相关质粒或siRNA转染，并在转染后48小时收获。使用Dual-Light System（Applied Biosystems）测量β-半乳糖苷酶和荧光素酶的活性。

体外剪接测定

体外剪接测定使用公开的方案进行28。简而言之，我们在PCR反应中使用了引物（5'-CGCGGATCCGTACTCCCTCTCAAAAGC-3'和5'-CCGGAATTCCTTCTCCGCCTGAGCCTC-3'）从pTN23质粒27（不具有pTN23质粒）扩增出含有外显子-内含子-外显子结构的DNA片段。T7启动子），并将其克隆到BamHI和EcoRI位点之间的pBluescript II KS（-）质粒（具有T7启动子）中。然后通过EcoRI线性化此构建体，并在体外用作底物T7 RNA聚合酶（Promega Part＃9PIP207）介导的转录反应。一个标准的剪接反应包含剪接的RNA（0.01-0.1纳米），20％HeLa核提取物，50和100纳克重组蛋白表示时，1mM的ATP，20mM的磷酸肌酸，3.2毫摩尔MgCl 2，10U核糖核酸酶抑制剂，1mM的DTT，60 mM KCl和12 mM HEPES-KOH（pH 7.9）。反应体积为25μl。在30°C下温育2小时后，将酶K用200μl的10 mM Tris（pH 7.5），1％SDS，0.15 mM NaCl，1 mM EDTA和0.2 g l -1消化。蛋白酶K在42°C下反应1 h，然后在RT-PCR之前提取酚氯仿并沉淀出乙醇。为了从核提取物中耗竭AKAP95，首先应按照产品信息中提供的方案将AKAP95抗体与CNBr活化的琼脂糖4B（Sigma，C9142）偶联，并在4°C下与核提取物一起孵育4 h。将上清液用作耗尽的提取物。

AKAP95敲低

我们对KD AKAP95使用了三种不同的策略，包括siRNA，shRNA和microRNA。它们的顺序见补充表2。。指示的细胞用siRNA瞬时转染，并在转染后2-3天进行分析。指示的细胞有时会感染表达shRNA的慢病毒并被嘌呤霉素选择。作为建立稳定的AKAP95-KD细胞系的替代方法，我们还使用了BLOCK-iT Pol II miR RNAi表达载体试剂盒（Invitrogen）来生成质粒，该质粒表达两个不同的AKAP95 microRNA（miR 1和miR 2）序列，分别链接为miR1。 -2-1-2两侧为BamHI和XhoI限制性酶切位点。将整个microRNA转移到BamHI和XhoI之间的pcDNA5 / FRT / TO（Invitrogen）中，并与pOG44（Invitrogen）共转染到Flp-In T-REx 293细胞（Invitrogen）中。用潮霉素B选择稳定的克隆，并在强力霉素诱导（100 ng ml -1）时具有有效KD的克隆（8号和12号克隆））被选作进一步研究。

PCR和qPCR

为了确定基因表达或剪接效率，使用RNeasy试剂盒（Qiagen）提取总RNA，并使用带有寡聚dT20引物的SuperScript III第一链合成系统（Invitrogen）进行反转录。对于基因表达，在ViiA7实时PCR系统（Applied Biosystems）上用SYBR Advantage qPCR Premix（Clontech）进行qPCR。补充表3中列出了使用的引物。为了进行剪接检测，使用EmeraldAmp Master Mix（Takara）在95°C 2分钟，然后在95°C 20 s，58°C 30 s和68°C 50 s的32个循环中进行PCR。将PCR产物在琼脂糖凝胶上分离，并通过ImageJ程序对条带的信号强度进行定量。

RNA免疫沉淀

将细胞用1.2％甲醛交联15分钟或用254 nm，400 mJ cm -2的紫外线照射。收集细胞（约5000万），并在2 ml放射免疫沉淀测定缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、1％NP40、0.5％右旋胆酸钠，0.1％SDS，1 mM EDTA，150 mM NaCl，1 mM中裂解DTT，50单位ml -1RNase Out）。细胞裂解物在Bioruptor（Diagenode）处以“高模式”超声处理60个循环，剪切至400-800 bp。离心后，将澄清的裂解物在4°C免疫沉淀过夜。用低盐（0.1％SDS，1％Triton X-100、2 mM EDTA，20 mM Tris-HCl pH 8.1、150 mM NaCl），高盐（0.1％SDS，1％Triton X-100、2）洗涤珠mM EDTA，20 mM Tris-HCl pH 8.1、500 mM NaCl），免疫LiCl（0.25 M LiCl，1％NP40、1％脱氧胆酸，1 mM EDTA，10 mM Tris-HCl pH 8.1）和TE缓冲液（1 mM EDTA，10 mM Tris-HCl pH 8.0）。蛋白酶K消化和Turbo DNase I（每个样品4 U）处理后，通过酸性苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀回收RNA。

RNA序列

使用测序试剂和流通池在Illumina HiSeq2500上进行RNA测序，每个流通池可提供多达300 Gb的序列信息。简而言之，使用Agilent 2100生物分析仪评估了总RNA的质量。对于mRNA-seq，进行2轮polyA +选择。对于包括输入RNA-seq的RIP-seq，不进行polyA +或其他选择，然后转化为cDNA。我们按照制造商的说明（Agilent，Santa Clara，CA）使用了链式mRNA文库生成试剂盒。文库构建包括RNA的随机片段化，然后使用随机引物在第一链反应中包含放线菌素D的cDNA生产。修复cDNA的末端，A尾并连接接头以在测序过程中进行标引（每个泳道有四个不同的条形码）。在产生簇之前，使用带有Kapa Biosystems试剂盒的Kapa Biosystems试剂盒（Kapa Biosystems，Woburn，MA），在Roche LightCycler 480中使用qPCR对cDNA文库进行定量。产生簇以产生每mm 2约725–825 K簇。在评估第一个碱基添加参数后，在运行过程中确定了簇密度和质量。我们进行了配对末端2×50 bp测序，以将cDNA序列与参考基因组比对。

生物信息学分析

我们为每个样本获得了35-55百万个配对的51 bp读数。在进行生物信息学分析时，研究人员对样品身份不知情。使用具有基因转移文件（GTF版本GRCh37.70）的TopHat（v2.0.13），将所有读数定位到人参考基因组（GRCh37 / hg19）。从分析中删除了低质量的映射读段（MQ> 30）。使用Picard-tools（v1.126）（http://broadinstitute.github.io/picard/）计算平均插入物大小和sd 。

对于mRNA-Seq，使用HTSeq（v0.6.0）53生成读取计数表，并使用DESeq（v3.0）54进行基因的差异表达（DE）分析。使用DEXSeq（v3.1）29执行防御外显子使用。DEseq和DEXseq中均包含两个独立的对照和KD生物学重复序列。对于293细胞，对照样品的mRNA-seq结果包括（1）由我们用强力霉素处理的亲代Flp-In T-REx 293细胞得到的结果，以及（2）由强力霉素处理的对照Flp-In T-REx 293细胞得到的结果。另一个与我们无关的小组执行的REx 293细胞（GSE44976中的GSM1095127样品）31，并且两个AKAP95 KD样品来自经过强力霉素处理后稳定表达AKAP95 microRNA的Flp-In T-REx 293细胞的两个不同克隆（miR＃8和miR＃12）。对于小鼠ES细胞，在我们实验室中，两个不同的人分别独立产生了对照和shRNA＃1介导的Akap95 KD的两个生物学重复。使用BEDTools（v2.17.0）55和bedGraphToBigWig工具（v4）生成了每百万个标准化的BigWig文件读取的数据。所有下游统计分析和生成图都在R（v3.1.1）（http://www.r-project.org/）中进行。基因本体分析在DAVID（http://david.ncifcrf.gov/）上进行。

对于RIP-Seq，将映射文件传递到基于模型的ChIP-Seq（MACS）分析（v1.4.2 20120305）56以进行峰调用和HOMER（vv3.12，6-8-2012）（http：// homer .salk.edu / homer /）57用于Motif查找。然后，基于百万读取的数据对MACS生成的基准图文件进行标准化，并使用bedGraphToBigWig将其转换为BigWig文件。输入的RNA-seq文件不受MACS约束。从上面使用的GTF文件中提取了注释的基因组区域（基因间区域，外显子，UTR，远端和近端内含子）。这些基因组区域的峰注释和覆盖率计算分别使用Bedtools和SAMtools（v0.1.18）58进行。轮廓图由ngs.plot（v2.47）生成59。

统计

所有数据均显示为带有sd的平均值。除非在图例中另有说明，否则在高斯（正态）分布的假设下使用未配对的两尾Student t检验来计算P值并评估两者之间差异的统计显着性。如图中的图例所示，表示样本，并且在进行统计学比较的组之间的方差相似。

资料可用性

RIP-seq和RNA-seq数据已保存在Gene Expression Omnibus数据库中，登录号为GSE81916。所有其他数据均应作者的合理要求提供。

附加信息

如何引用本文： Hu，J.等。AKAP95通过支架RNA和RNA加工因子调节剪接。纳特社区 7， 13347 DOI：10.1038 / ncomms13347（2016）。

发行人的注释：对于出版的地图和机构隶属关系中的管辖权主张，Springer Nature保持中立。

标签：splicing,regulates,外显子,RNA,AKAP95,hnRNP,结合,剪接
来源： https://blog.csdn.net/u010608296/article/details/113003186