Optimized fragmentation improves the identification of peptides cross-linked by MS-cleavable reagent
作者：互联网
题目：Optimized fragmentation improves the identification of peptides cross-linked by MS-cleavable reagents
期刊：Journal of Proteome Research
发表时间：29 January 2019
DOI: 10.1021/acs.jproteome.8b00947
作者及单位：
Christian E. Stieger——Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna BioCenter (VBC), Vienna, Austria
Philipp Doppler——Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna BioCenter (VBC), Vienna, Austria
Karl Mechtler—— 1) Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna BioCenter (VBC), Vienna, Austria；2) Institute of Molecular Biotechnology (IMBA), Austrian Academy of Sciences, Vienna BioCenter (VBC), Vienna, Austria；3) Gregor Mendel Institute (GMI), Austrian Academy of Sciences, Vienna BioCenter (VBC), Vienna
分享人：张宇星
概述：
化学交联质谱技术（Cross-linking Mass Spectrometry）在研究蛋白结构、蛋白互作网络中起着越来越重要的作用，在化学交联质谱中，质谱仪器的选择，方法和参数的优化对于不同的交联试剂都有很大的差别，从而对最终的鉴定结果产生影响。
在常用的交联试剂中，质谱可碎裂（MS-cleavable）交联试剂由于可以在碎裂谱图中产生特征离子对，并且不受搜库时数据库大小的影响，对于提高交联肽段的鉴定准确性和数目有帮助，但是目前关于不同碎裂能（NCE）对交联肽段的鉴定的影响和参数优化还没有系统的研究，本文针对目前市场上最常用的质谱可碎裂交联试剂DSSO、DSBU（图1）参与的交联肽段在不同碎裂能下的结果做了细致的研究，并提供了最优化的参数设定。
图1：DSSO，DSBU的结构，红色虚线部分为在质谱中碎裂时的断裂位置。
实验结果：
（所有的质谱数据均产于 Orbitrap FusionTM LumosTM TribridTM (Thermo Fisher Scientifi)
首先针对DSSO反应的交联肽段，对于每一个样本分别使用9种不同的NCE（15、18、21、24、27、30、33、36、39）去进行离子的碎裂，并对不同碎裂能下的离子碎裂情况进行分析。
图2：交联肽段的鉴定数目及被鉴定肽段的平均打分
图3：（A）不同碎裂能下交联肽段的平均序列覆盖度；（B）至少包含2个不同的交联报告离子对的谱图数（n=3，95%置信区间）；（C）（D）同一个母离子在不同碎裂能下的碎裂结果。
结果显示，当NCE为21和24时鉴定到的交联肽段最多，当NCE大于27后，鉴定率会有显著的下降（图2），但是随着NCE的增大，交联肽段产生的碎裂离子数目更多，最终肽段的序列覆盖率随着NCE的增大而上升（图3 A，C，D），这一点也可以从NCE增大导致鉴定到的交联肽段在PD2.3中的得分越高的现象中得到佐证（图2）。进一步的分析发现低电荷的母离子（3/4+）和相对低的核质比（m/z < 750的3+离子和 <700 的4+离子）可以产生70%的肽段序列覆盖度，而高核质比的母离子在质谱中的碎裂较差，从而导致低鉴定率。
通过人工去检查交联肽段的二级谱图，统计至少包含1对DSSO产生的特征离子对的谱图时发现，NCE在15-24之间可以产生超过1000张包含至少一对特征离子的二级谱图，但之后随着NCE的增加，谱图数明显减少，当NCE为39时只得到237张谱图（图3 B），而DSSO的碎裂特征离子对在搜库软件XlinkX的算法中是作为判断交联肽段的重要依据，这也进一步解释为什么高NCE会导致鉴定率的下降，但值得注意的是，低NCE时含有特征离子对的谱图最终被鉴定为交联肽段的转换率要远低于高NCE时（NCE 15时约为33%，而NCE大于30时可以达到86%）。
之前的报道中曾提到DSSO更适合用CID模式碎裂，但本文的结果发现，在15-24的NCE时就可以达到NCE 30时CID的交联肽段谱图数，证明HCD较CID更适合用于DSSO交联肽段的鉴定。由于不同碎裂能产生的二级谱图在对于交联肽段的鉴定中各有利弊，所以本文探索了使用结合不同碎裂能的分步碎裂模式（stepped NCE），分别为24±3、27±3和27±6，结果发现，stepped NCE 为27±6时可以鉴定到的交联肽段数目最多（图4）。
图4：不同分步碎裂能对交联肽段的鉴定比较（n=3，95%置信区间）
得到最优参数后，作者将其与之前已报道的方法进行比较，发现无论是在简单样本BSA还是在复杂样本大肠杆菌70S核糖体中，使用他们优化后的分步碎裂可以鉴定到最多的交联肽段（图5）。
图5：不同方法在BSA与70S E.coli 核糖体中交联肽段鉴定的结果比较
个人观点：
这篇文献首次系统的研究了不同碎裂能对于用可碎裂交联试剂连接的肽段碎裂的影响，通过优化找到了最为合适的分步碎裂能量（27±6），并通过比较证明这种方法与之前人们所接受的CID-ETD碎裂模式以及通过打三级质谱来鉴定交联肽段的方法相比，能够鉴定到更多的交联肽段，其结果对于扩展交联质谱技术的使用范围有重要的意义，尤其对于因为没有ETD源或者无法打三级质谱的实验室来说，也可以凭借这个方法开展利用交联质谱研究蛋白分子结构和蛋白互作网络的工作。当然本文所对比的两种质谱方法也被后来不少实验室进行过优化，所以我个人认为文章中鉴定率比前两种方法高的结论不一定准确，但至少提供了一条新的思路，为这个领域做出一定贡献。
标签：fragmentation,鉴定,张宇星,碎裂,质谱,Optimized,交联,NCE,Vienna 来源： https://www.cnblogs.com/ilifeiscience/p/10577675.html