易基因｜植物靶基因DNA甲基化研究超级问答 | 想知道的都在这里 植物靶基因DNA甲基化研究超级问答 | 想知道的都在这里
作者：互联网
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DNA甲基化在植物基因组中以CG、CHG和CHH三种碱基序列的胞嘧啶上发生（H=A，T或C），甲基化转移酶包括DRM，CMT和MET等。在植物中，DNA胞嘧啶的甲基化会导致基因表达的改变和转座因子的失活，修饰状态的改变可能产生具有不同表型状态的表观等位基因。
近期不少老师咨询植物能不能做靶基因（单个或几个目标基因）DNA甲基化测序，易基因小编连夜奋笔疾书，将老师最关心的植物靶基因甲基化问题进行整理，最全面的解答来咯。
Q：DNA 甲基化在植物中的作用
A：DNA甲基化是生物体中非常重要的调控模式，在基因表达、转座子沉默、染色质相互作用、细胞分化以及生长发育过程中起着重要作用。植物DNA甲基化模式的改变不仅可以影响植物的花期、育性、花以及叶的形态等生命活动，而且在植物印记、逆境胁迫和杂种优势等方面也发挥着一定的作用。Q：植物DNA甲基化测序方法有哪些？
A：植物DNA甲基化测序方法通常用的是全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS），包括常规WGBS、微量样本WGBS（Micro DNA-BS）、单细胞scWGBS，另外还有植物简化基因组甲基化测序（Plant-RRBS）和免疫共沉淀测序（MeDIP-seq），适用于不同研究需求。
Q：植物能做靶基因的DNA甲基化检测吗？
A：植物基因组中CG、CHG和CHH等单个C碱基都有甲基化。目前主要的研究方法还是以植物整个区域亚硫酸盐测序为主，单基因甲基化没有很好的方法，前期探索研究可用MSP方法（特异性甲基化PCR）。虽然有个别文章通过BSP测序检测单基因甲基化，但不是非常建议，如果物种基因组不大，直接全基因组甲基化测序就可以，无论是成本还是准确性都更优，没必要检测单个基因。
图：靶基因甲基化测序技术原理
Q：植物靶基因甲基化按照目标基因设计特异引物进行PCR扩增是否为一种可行性方法？
A：首先，不确定单个C是否甲基化，如果未被甲基化，亚硫酸盐转化会将其变为U，甲基化保持C碱基不变。
其次，引物里如果有C碱基，无法确定设计成C碱基或T碱基。只有在上下游引物都不含C或只含1-2个C，单条引物把各种可能性都纳入考虑，确保上下游引物不含C碱基。举例说明，引物里有2个C，那1条引物的排列组合就是CC/TC/CT/TT四种。
此外，如果区域较大，基因引物设计需要考虑各种组合。不仅花费大量的时间，还不一定能有效扩增出产物。特别是甲基化转化后PCR自身就很难扩。如果甲基化模式只发生在CG岛，单基因或多基因都可以做。但植物DNA甲基化可以同时在CG、CHG和CHH都存在，主要受CHH等甲基化模式的影响。
Q：植物全基因组甲基化测序能避免靶基因甲基化引物设计的问题？
A：全基因组甲基化测序技术是通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
全基因组甲基化测序并非通过基因组序列进行扩增，因而完全可以避免靶基因甲基化引物设计中遇到的问题。
Q：想了解植物目标基因的甲基化水平，应该怎么做？
A：现有测序技术首选还是全基因组甲基化测序。
技术层面，全基因组甲基化测序可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。
价格层面，只PCR扩增，单个PCR产物约300元左右（测序读长是300），基因组PCR设计（引物设计合成）5000bp约1000-2000元/样本，加上后续的建库、测序、分析费用，价格不低。而同等测序数据量的全基因组甲基化从样本提取到建库测序分析全套价格并不比靶基因甲基化测序高。
研究成果方面，植物靶基因甲基化在引物设计PCR扩增中不一定能扩增出产物。即使能扩增出产物，如果引物设计不当，研究出的结果也极有可能不被认可。因为存在选择性扩增的问题，哪怕在引物设计时把所有排列组合都考虑到，扩增时还是会优先扩增某种组合的引物。最后要么没有结果，要么结果不被认可。
综上所述，植物全基因组DNA甲基化是一种更有效、更直接、更省钱的技术。
Q：预算有限时，植物的DNA甲基化研究方法推介？
A：全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）是植物甲基化检测金标准。如果预算有限，可以考虑植物简化基因组甲基化测序，易基因研究团队创建的双酶切DRRBS（Plant-RRBS）被同行研究证明，对于大基因组或植物群体基因组甲基化的检测极为有效，胞嘧啶覆盖广泛。
标签：DNA,测序,基因,基因组,甲基化,引物 来源： https://www.cnblogs.com/E-GENE/p/16347436.html