知识积累 | 10X数据是个啥？
作者：互联网
之前说，实验室主要使用的是10X的数据，但是我现在对于10X的数据的了解很少。所以，想更进一步的了解一下。从网页上搜集到资源，整理如下。
RNA-seq技术的主要的目标就是（1）定性（2）定量。所以，在某种程度上，就是围绕着两个目标进行的，只不过提出的解决方法会有所不同。
一句话总结：单细胞测序技术与单细胞核测序技术的区别？
简而言之，就是单细胞测序技术存在一些弊端。只能够取样于新鲜组织，而一些临床的冷冻的样本，无法得到利用。在解离的过程中，一些细胞这种应激的条件下，基因的表达发生变化。同时，一些不易解离的细胞类型也会因此被过滤掉，而使我们最终的分析丧失一些重要的信息。
因为这些问题的存在，所以我们现在发明了单细胞核技术。主要的不同点在于，单细胞测的是细胞质+细胞核的遗传信息，而单细胞核如其名，测的是细胞核内的遗传信息。由于细胞核膜相对于细胞膜是更加稳定的，所以在实验的过程中也更加容易操作，从而规避了我们上面提到的一些单细胞测序技术的弊端，临床冷冻的样本的遗传信息也能够得到有效的利用。
那么，这个时候我们可能会问，单细胞核测序技术只是测序了细胞核内的遗传信息，那么，没有得到细胞质内的遗传信息（如部分mRNA,因为我们知道，成熟的mRNA,要在细胞质中进行翻译。）对于整体的影响大吗？从目前的实验结果上看，snRNA-seq的表现与scRNA-seq完全一致，同样能够准确的捕捉到细胞的转录状态，这一点已在不同组织、不同外界处理条件等多种情况下得到了证实。
链接：https://www.bilibili.com/read/cv7136279/
主要的过程:
（1）Gel bead与细胞结合，形成GEMs。
在这个过程中，与细胞结合并标记细胞的Gel bead由四个部分组成。各有其各自的作用。
- R1：为一段已知序列的DNA片段，用于后续的测序。
- 10X Barcode：用于标记细胞。
- UMI：在混合测序的过程中，用于区分不同的cDNA来源的reads。也就是在后续的建库扩增的过程中，cDNA不断的扩增产生reads,来源于同一个转录本的reads的UMI相同。
- poly(dT)VN：通过与mRNA的polyA尾互补配对，捕获细胞中游离的mRNA。
每一个细胞有一个特征的UMI。之后，在进行扩增建库的过程中，只要是由该细胞扩增产生的cDNA,都会带有这段UMI。
（2）建库
通过某种方法，将细胞裂解，释放出mRNA,利用逆转录酶，将mRNA反转成双链cDNA,进行扩增。而Gel bead所起到的作用就是，将我们细胞中的mRNA的序列信息捕获，然后通过反转录的方式，转换为带有特征的细胞标记的reads。
由于这个平台的测序过程是高通量的。所以，将所有的reads（来源于不同的细胞的不同的mRNA）都集中起来进行测序。而后续的过程中，如何将这些不同来源的reads区分开来，就是利用我们的标记。
一般而言，有几个维度的标记：
- 来自哪一个样本（患者，如果是一个个体的某个组织的话，另当别论）
- 来自哪一个细胞（因为我们要在细胞维度上，进行表达量的识别，所以这部分的信息也很重要）
——10X barcode - 来自哪一个基因（通过基因的识别，我们知道是哪些基因的表达）
——UMI
所以，最终表现在counts矩阵上，就是行为所在的细胞，列为基因，值为定量后的表达值。
（3）生物信息学分析
一般而言，会使用Cell Ranger，以及随后使用的seurat包进行数据的处理。
参考链接：https://www.jianshu.com/p/ef88433709bd
特征：
（1）非全长的测序，通过测序3’端，来定量基因的表达。具有较强的3’端偏好性。
（2）测序样本，要求90%以上活细胞。
（3）真正意义上对单个细胞的表达量进行汇总。
（4）通量高，建库周期短。10X Genomics 一次测序可以捕捉100-80,000个细胞，具有极高的细胞通量。单细胞的测序通量平均也在50,000 reads/每一个细胞，而如果使用细胞核进行测序则平均通量为25,000 reads/每一个细胞核。
（5）具有较为严重的drop out问题。
什么是drop out问题？这个问题是单细胞测序技术的普遍的问题，只不过10X的方法得到的结果更为显著。具体表现在，一些基因在一些细胞中根本检测不出表达，在另外一些细胞中则显著高表达（排除生物学因素影响）。
如何理解单细胞测序过程中的覆盖率？
标签：积累,知识,测序,reads,细胞,10X,mRNA,细胞核 来源： https://blog.csdn.net/weixin_40640700/article/details/117222450