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图解 | Cell三篇牛文详解CRISPR两大家族及操作法则

作者:互联网

近日,CRISPR专利大战以张锋一方获胜而暂告一段落。显然,早已风靡生物医学界的CRISPR凭此又火了一把,而Cell杂志三篇牛文则对CRISPR系统及操作进行了详细地归纳总结,可让大家真正掌握CRISPR基因编辑技术之精髓。


CRISPR两大家族


CRISPR-Cas系统是原核生物中的适应性免疫系统,而基于效应蛋白可分为两个不同的类别:Class 1和Class 2。其中,Class 2系统(尤其是基于核酸酶Cas9的系统)已成为最热门的基因编辑工具。


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1类CRISPR家族


Class 1系统被分为3个类型、12个亚型(如下图)。多种细菌和古细菌中均含有该类系统,比如嗜热微生物中富含1类III型CRISPR-Cas系统。


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除了常见的Cas蛋白外,1类CRISPR-Cas系统中还有一些其他辅助性蛋白,如逆转录酶(RT)、CARF蛋白家族。


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该系统在形成获得性免疫记忆时,除了一些不走寻常路的III-B系统(对逆转录酶情有独钟),其他的则是完全仰仗Cas1和Cas2这两个左膀右臂,尤其对Cas1的核酸酶活性十分依赖。通常Pre-crRNA会携手Cas6e/ Cas5d进化为成熟crRNA,并结合相应蛋白组装成复合物形式;而后在外源分子***时,复合物会招募御用的Cas3核酸酶对“侵略者”进行切割瓦解。


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正所谓,道高一尺魔高一丈。外源“侵略者”也不是好欺负的,为了抵抗细菌的这套CRISPR免疫系统,已有某些噬菌体能够编码多种抗CRISPR蛋白(Anti-CRISPR Protein),来进行免疫逃逸。


2类CRISPR家族


目前,2类CRISPR-Cas系统被分为3种类型、9个亚型。该系统的大多数会编码Cas1、Cas2和一些辅助蛋白如Cas4,而只有VI型系统独树一帜,仅由CRISPR阵列和效应蛋白组成。


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2类系统主要有3类效应蛋白:RuvC样核酸酶结构域(RNA酶H折叠)、HNH家族核酸酶和HEPN超家族的两个核糖核酸酶结构域。且不同于1类CRISPR,CRISPR/Cas9系统在清除外源基因的过程中有着特殊的机制:首先需要tracrRNA,其次需要体内RNaseIII的参与。


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另外,对外源基因常被CRISPR/Cas9系统KO的方式如下:1)tracrRNAs和pre-crRNA中的重复片段区域杂交,Cas9和crRNA-tracrRNA结合;2)RNase III从spacer的5’端开始剪切,产生不同类型的成熟的crRNA-tracrRNA-Cas9的复合物;而后复合物通过PAM位点与相匹配的外源基因结合并剪切。


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目前2类系统主要应用于以下三个方面:1)基因编辑,包括基因敲除、基因敲入以及引发突变;2)基因调控以及递送各种功能的部件(如转录因子)到DNA中特定的位置;3)靶向***NA。


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CRISPR操作的中心法则


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当外源dsDNA被注入细胞时,Cas1/2蛋白可识别外源DNA原间隔序列临近基序(PAM:三碱基NGG,N为任意碱基),并将原间隔序列(protospacer)剪切并插入到CRISPR序列前导区的下游中,完成外源DNA的捕获。


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在I型和III型系统中,初始CRISPR转录产物(Pre-crRNA)会被CRISPR特异性核酸内切酶(Cas6 / Cas5d)在重复序列位点内切割形成成熟的crRNA。


在II型系统中,Pre-crRNA可通过重复序列与其互补序列transacting RNA(trancrRNA)反式结合,然后在Cas9存在的情况下被RNaseIII加工融合成一个sgRNA。


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I型和II型系统均可靶向含有与PAM和protospacer互补序列的dsDNA底物。不同的是,在I型系统中,通过含有多个亚型的复合物结合到dsDNA,并招募反式核酸酶Cas3对DNA进行靶向干扰。在II型系统中,则通过Cas9蛋白的HNH酶活性剪切crRNA互补的DNA链及其RuvC活性位点剪切非互补链,促使dsDNA断裂。


类似于I型系统,III型系统也同样依赖于具有核酸酶活性的多亚基复合物对靶向DNA进行干扰,但不同于I型和II型系统,III型系统不依赖于PAM进行靶标位点的识别,而是通过碱基互补配对来识别靶序列并进行DNA的裂解。


参考文献:1、SnapShot: Class 1 CRISPR-Cas Systems

2、SnapShot: Class 2 CRISPR-Cas Systems

3、SnapShot: CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems 

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标签:DNA,核酸酶,Cas,系统,Cell,crRNA,牛文,CRISPR
来源: https://blog.51cto.com/u_15127638/2777808