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针对STED,如何选择荧光团偶联抗体?

作者:互联网

 

先来聊聊目前几种常见的SRM(超分辨率显微镜)技术原理:

 

一、受激发射耗竭(STED)显微镜

 

STED对于有经验的荧光显微镜使用者来说相对简单,该方法和普通共聚焦显微镜(Confocal)的原理相同。普通Confocal使用单光源,而STED使用双光源。其中一个光源发射能激发荧光团——荧光标签(研究者们以此来定位和观察蛋白)的光,另一个光源发出不同波长的光,用于抑制荧光。这束光是环形的,并且与第一束光有所重叠,因此只有环形中间区域的分子会继续发出荧光。

 

获得STED超分辨率图片并没有那么复杂,用户需要仔细调整参数,才能得到漂亮的结果,否则所得图片和普通confocal没有差别。

使用传统和RESCue受激发射减损显微镜(STED)得到的细胞核膜上核孔复合体的图片。

 

STED的原理:

 

显微镜透镜对光的衍射会导致来自单个点的光出现在较大的区域,这称为点扩散函数(PSF)(见图1),由于PSF的存在,使得常规显微镜无法达到超分辨。

在普通光学显微镜中,成像是通过将来自点光源的光线会聚到像平面上的单个点来实现的。超出光衍射的限制,防止了射线的精确会聚,从而导致物体的图像模糊。显微镜的分辨率取决于点扩散函数(PSF)的大小,或对象在某个点的三维强度分布。在STED中,应用环形炸弹耗尽型激光器,其零点与激发激光焦点的最大值重叠。STED激光器引起荧光的“饱和耗尽”,从而“抑制了来自零点附近区域的荧光,导致有效PSF的尺寸减小”。

 

而受激发射耗竭(STED)显微镜通过限制样品的荧光区域(PSF)产生超分辨率图像。STED显微镜使用两个重叠的激光,第一个按照常规显微镜激发荧光团(图2A)。第二个激光器称为耗尽激光器(STED激光器),它激发“甜甜圈”形状的激光,其中心的零强度点非常小(〜30 nm)(未激发)。除了在甜甜圈的中心处之外,第二激光起到了“关闭”第一激光所产生的外圈荧光,从而将样本激发的荧光分子范围缩小到中心圆点处,这有效地降低了PSF,以产生非常小的单分子荧光聚焦区域,从而获得高分辨率图像(图2D)。

1.单个小于250 nm的蛋白质无法通过标准共聚焦成像解析,从而导致图像模糊

2.STED耗尽激光器产生了淬灭外围荧光的“甜甜圈”

3.饱和耗尽在功能上降低了激励PSF

4.随之可以解析单个蛋白质

 

适用于STED的荧光团偶联抗体:

 

为了获得超分辨率,染料必须具有STED激光波长的高发射截面,并有效地实现高饱和度。这种强烈的照明确保了所有被STED激光“关闭”的分子都受受激发射的支配。合适的染料应具有低的光漂白性,具有高的量子产率和对比度,并在目标附近具有足够的标记密度。如下列染料标记的二抗已被验证在STED中成功使用:

 

Alexa Fluor 488标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗,#115-545-003

 

与传统的荧光团相比,具有发光亮度更强,灵敏度更高,背景更低的优势,同时其对pH的稳定性更好,发光 也更持久,因此更适合于拍照。Alexa Fluor荧光荧光染料作为荧光显微镜、细胞生物学和分子生物学内的生物分子、细胞和组织标记物,可应用于生物技术和研 究等众多领域。

 

二、随机光学重建显微镜(STORM)

 

最初所有的荧光标签都是暗的。然后使用激光脉冲来激活一小部分荧光标签,随后使用另一束光来关闭这些荧光标签。不断重复这个过程,生成一系列部分荧光图,最后重建成整个视野的荧光图。以产生分辨率优于常规方法收集的图像。

使用超分辨率随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM),科学家首次观察到了神经元轴突的细胞骨架。

 

用于单分子定位实验的荧光团偶联抗体

 

用于单分子定位的最佳染料通常非常亮,并产生足够的光子以可靠地产生紧密的高斯分布。例如艾美捷Jackson 的AlexaFluor®488,AlexaFluor®647和Cy™5,可用于这些类型的实验。建议用于超分辨率显微镜的荧光染料偶联物。

 

每种SRM技术都有各自的探针选择要求,需要注意的是,SRM领域变化迅速,因此,建议从专业技术文献中寻求信息,以帮助选择合适的荧光团。

 荧光抗体链接:

http://www.amyjet.com/featured/srm.shtml

标签:显微镜,STED,分辨率,激光,PSF,偶联,荧光
来源: https://www.cnblogs.com/abbkine/p/14217599.html