酶联免疫吸附实验法

　　酶联免疫吸附实验法采用酶标记技术，使待测标本与事先包被在塑料凹孔板内的相应抗原或抗体相结合，形成免疫复合物。酶标抗原或抗体与此结合形成酶标记的免疫复合物。当加入酶的相应底物时，由于酶的催化作用，呈现颜色反应。颜色的深浅与相应的抗原或抗体的量成正比。

　　这样，原来人体中无色的抗原或抗体，与酶联接后仍保持免疫和酶的活性。当加入底物后，能使底物显色。抗原或抗体的含量越高，颜色就越深。这样，便可根据所生成的颜色的深浅，来分析抗原或抗体的含量。

　　酶标法（并称固相酶免疫测定）可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3个必要的试剂：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的性状以检测的具体条件，可设计出各种不同的检测方法。现介绍3种最常用的方法。

（一）抗体夹心法

　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，图1为其示意图。具体操作步骤如下：

图1  双抗体夹心法测抗原示意图

（1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。然后洗涤除去未结合的抗体及杂质。

（2）加受检标本使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。然后洗涤除去其他未结合的物质。

（3）加酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。然后彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时，固相载体上带有的酶量就代表标本中受检抗原的量。

（4）加底物显色。夹心式复合物中的酶催化底物变为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

　　本法只适用于二价或二价以上大分子抗原的检出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。

（二）间接法

　　间接法是检测抗体最常用的方法，图2为其示意图。其原理为利用酶标记的抗体来检测已与固相抗原结合的受检抗体。操作步骤如下：

图2  间接法测抗体示意图

（1）将特异体抗原与固相载体联结，形成固相抗原。然后洗涤除去未结合的抗原及杂质。

（2）加稀释的受检血清，使血清中的特异性抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

（3）加酶标抗免疫球蛋白（酶标抗体），它与固相复合物中的抗体相结合，从而使该抗体间接地标记上酶。清洗后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。

（4）加底物显色，颜色深度代表标本中受检抗体量。

（三）竞争法

　　竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此，结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量成正比，其示意图如图3所示。具体操作步骤为：

图3  竞争法测抗原示意图

（1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。然后洗涤。

（2）在待测管中加入受检标本与一定量的酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。若受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。若受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合。这样，受检标本中抗原量越高，则由于这些抗原与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相抗体结合的机会，使酶标抗原与固相抗体的结合量越少。“参考管”中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。然后洗涤。

（3）加底物显色。参考管中由于结合的酶标抗原量最多，故颜色最深。参考管中颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本中抗原的量。待测管越淡，表示标本中抗原量越多。

 

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