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《初入实验室的学问与技巧》第二讲《设计且完成一个课题》

作者：互联网

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一、设计课题的原则

课题的确定和开题报告

重点是无论怎么命题，都要把现在的题目高高兴兴完成了。

二、读文献

在做实验的过程中理解你的工作

三、已知课题，设计思路

范例

《Tau蛋白与DNA的相互作用》

一、课题开展第一步：确定神经细胞核是否有Tau蛋白？

进一步：分离出细胞核，里面确实有Tau蛋白。（用多种方法，一种比一种精确）

再进一步：动物脑内细胞核里有Tau蛋白。

再进一步：必须证明没有Tau蛋白的细胞核内，没有Tau蛋白。

以上的工作仅仅证明了细胞核存在Tau蛋白，还没有到DNA与Tau的结合。

  1. 最简单的凝胶电泳——与Tau结合的DNA迁移变慢，并且发现Tau与DNA的结合无序列选择性——如何结合？
  2. 首先研究DNA与Tau蛋白的结合特点。（这一步很难也很关键，很多人死在了这一步）
  3. 原子力显微镜检测tau与长链DNA的结合
  4. 电子显微镜发现神经tau与DNA相互作用形成“复合物小体”或“串珠样模型”。

but，还是仅仅止步于Tau能够与DNA结合，并形成“结合小体”。

究竟Tau蛋白与DNA是如何结合的，需要进一步证明。

  1. 发现DNA与Tau的最小结合单位为13bp（方法没看懂，不重要），还要进一步确定
  2. 原子力显微镜显示正结果，也是13bp。还应该证明Tau蛋白在DNA上的结合部位。证明Tau蛋白应该结合在DNA大沟，还是小沟？——这一步很难，怎么做？注意分析DNA的结构，什么样的分子会结合在大沟上，什么样的分子会结合在小沟上，为什么？（这样思考除了探究可能的方向，也能启发我们的实验方法）知识：大沟可以有很多种排列组合，有特异性结合位点，因此结合的大多都是一些调控DNA功能和表达分子。小沟的结构比较单一，因此缺乏特异性结合位点，连接的是其他分子。【注意与其他知识的串联】
  3. 猜测结合的是小沟，因此用distamycin A先结合DNA，然后发现Tau的结合受到了抑制。——应该进一步证明Tau蛋白结合在DNA小沟上。
  4. Dnase实验进一步验证了DNA小沟是Tau蛋白的结合位点。——工作还不完善，还需要进一步验证。——还没有排除DNA大沟结合的可能性。
  5. 加了甲基蓝（和大沟结合），Tau仍然结合——说明大沟不结合Tau。Methyl G排除了DNA大沟的可能性。——工作还不完善，还需要进一步验证。——Tau蛋白的哪个domain与DNA结合还不知道呢。
  6. 通过Tau蛋白突变体的克隆、表达、分离、纯化，采用MESA证明：微观结合结构域和脯氨酸丰富结构域共同参与DNA的结合。【蛋白质分离纯化特别麻烦，是必须学的技术，由此也可以想想，什么是我必须学的技术】——哪些氨基酸参与了结合？
  7. 通过干扰，发现两个结构域上的lysine参与了结合。——如果是Lysine参与了结合，哪些条件影响其结合？【不只是苛刻的要求，也是对证据的补强】
  8. 发现碱性条件干扰结合，即静电作用。——Tau蛋白与DNA结合，究竟有什么生物学意义？【这看上去像一开始问的第一个问题，但其实也不是。在已经深入研究之后，也许发现了更为深入的意义，也许还要进一步探索，这不是课题的意义，而是你所探究的这个现象在现实中存在的合理性】
  9. 结果发现：Tau蛋白与DNA结合可以形成”似球状“小体，Tau被磷酸化就不会形成小体，而只有形成小体的才不会受自由基攻击解体。也即，Tau蛋白具有保护DNA免受自由基的攻击损伤。
  10. 可以写论文了，但在论文写作过程中，还需要补充实验。

  1. 新的发现：为什么之前是13bp：DNA双链上，同一个方向上有两个小沟的最短长度是13bp，只有Tau结合在一个方向上才会掰弯DNA，把DNA拖慢【实验对自己的思维进行了补强，又产生了新的想法，同时，这也需要一点想象力】

通过这个研究，我们的收获

Ps. 其他感悟

发论文时应该尽可能多的受到训练

生命科学体现出来结构与功能的高度一致性，同时各种实验技术也是在以各种方式逼近结构，猜测功能，这一点对我的工作是否有所启发。

技术非常重要，实验的细节决定成败。

耐心耐心再耐心，你以为不必要的每一个步骤都不能省。

PPS.图片都是赫老师PPT的，请勿转载。

标签：课题,Tau,DNA,小沟,初入,结合,蛋白,学问
来源： https://blog.csdn.net/m0_59476351/article/details/118367272