一、chip-seq（研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法）

一个染色质

1、调控染色质形态：组蛋白修饰、染色质重塑、DNA甲基化

2、作用机制

1、用交联剂，把与DNA互作的蛋白固定住，防止在两到三天的实验中，从染色质上脱落
2、用抗体识别并结合染色质上的靶蛋白
3、纯化富集靶蛋白
4、靶蛋白脱离下来
5、解交联，使蛋白和DNA分离
6、纯化DNA
7、得到所有与靶蛋白结合的DNA片段

3、三种类型组蛋白：组蛋白、转录因子

①组蛋白与DNA的结合是结构性的，结合强度非常大，分度高，是最容易做的蛋白
②TF直接与DNA结合，有序列特异性，比较短，只有几个bp，TF与DNA的结合牢固度，弱于组蛋白
③转录调控子，不直接和DNA互作，与TF或组蛋白互作，和DNA间接结合在一起，容易在交联剂上脱落（第一步），通常作为大蛋白复合体中的一员起作用，表面抗原容易被蛋白复合体中的其他蛋白组分所阻挡，从而影响抗体的富集（第二步）。

4、交联时间

histone：10 min
TF：10-30 min
cofactor：30 min
不超过30min，防止影响解交联及后续的过程

5、对剪切条件的敏感性

histone：low
TF：medium
cofactor：high

6、酶解法、超声波法

酶解法：核小体间信息
超声波法：核小体蛋白组分上的完整性
两种方法对实验结果有影响，各有优劣

二、ChIA-PET

1、ChIA-PET三个部分：湿实验、干实验（数据处理）和实验验证

①、ChIA-PET湿实验可划分为三大步：ChIP富集、DNA片段的邻近连接和连接产物的片段化及测序(Jietal.,2016)。

ChIP是一种研究DNA与蛋白质之间交互的方法。

1. 先乙二醇、再用甲醛进行双交联，固定DNA-蛋白质复合物。细胞溶解去除胞质蛋白，再使用超声波破碎，染色质通常应该打断为200bp到600bp的DNA片段，其平均长度为500bp。

short-readChIA-PET： read长度为36bp，测序的DNA片段长度为20bp左右
long-readChIA-PET： 平均长度为300bp(Tangetal.,2015)

2. 加入目标蛋白抗体，富集含有目标蛋白的DNA-蛋白质复合物。

short-readChIA-PET：两种half-linkerA和B分别加到两等份样品中用于linker连接。将这两等份混合时，两个half-linker连接在一起构成了全长的linker序列。half-linker与ChIP-DNA结合的一端中包含MmeⅠ酶的一段识别序列，以实现第三步片段化。使用MmeⅠ向ChIP-DNA方向切割20bp，以此得到tag-linker-tag格式的PETs（Paired-EndTags）。Tag指的是使用MmeⅠ酶切下来的ChIP-DNA片段，每对tags经过PCR扩增再进行测序分析。

Long-readChIA-PET：加入一条生物素标记的bridge linker序列进行邻近连接。使用Tn5转座酶将连接产物片段化，同时加上测序接头。同样，最后进行PCR扩增和测序。

2、两个R包——交互可靠性的评估。

MC_DIST：基于混合模型的R包，此模型考虑了数据的依赖性以及蛋白结合位点和基因启动子的可用信息降低假阳性(NiuandLin2015)
MICC：使用贝叶斯混合模型，系统去除随机连接或随机碰撞产生的噪音(He et al., 2015)
BWA善于将DNA序列比对到参考基因组上

标签：片段,DNA,PET,linker,测序,技术,学习,蛋白
来源： https://blog.csdn.net/viola_/article/details/117755220