如何在心脏中找到初级纤毛，并验证疾病机制

初级纤毛：一种成纤维细胞促心肌纤维化的重要细胞器。

纤毛是一种突出于细胞表面的呈毛发状的细胞器，根据结构和功能可分为运动纤毛和初级纤毛。运动纤毛的功能主要是协助细胞运动；而初级纤毛则静止不动，对细胞外信号具有敏锐的感知能力，是细胞内外信号传递的平台。

早在1898年研究人员发现了初级纤毛，而直至在过去10年中，一些研究明确证明了初级纤毛在传递流体流动、压力、激素、代谢物和生长因子等信号的关键作用，因而引起了科研人员对初级纤毛的兴趣。初级纤毛存在于神经元、前脂肪细胞和肾小管细胞等多种静止细胞中，并且参与增殖、分化和细胞周期等多种细胞病理生理过程。

现阶段，初级纤毛在心血管领域的研究寥寥可数，其对心血管的作用尚待阐明。尽管1970年代的一项开创性研究报道人心脏组织中含有纤毛，但心脏中纤毛的特定位置和功能均未曾阐明。虽然已有研究者发现纤毛与心脏发育显著相关，小鼠纤毛缺陷可引起先天性心脏病，但成人心脏中初级纤毛的作用尚未见报道。

本文的研究者发现Bardet-Biedl综合征和常染色体显性多囊肾病等多种以初级纤毛功能障碍或结构改变为特征的纤毛病伴随多种心血管疾病（如主动脉瓣发育不全）这一现象，猜想初级纤毛与心脏发育及病理变化密切相关，于是探索了初级纤毛在心脏中的具体位置及其在多种心脏疾病中的具体作用机制。

为验证心脏中存在初级纤毛，研究者首先在新生小鼠和成年小鼠心脏检测并发现了初级纤毛。由于初级纤毛在很大程度上影响小鼠的发育，研究人员接着检测了不同发育阶段的小鼠胚胎心脏中初级纤毛，并发现了初级纤毛的存在。

利用免疫荧光共定位的原理，研究者发现心脏中的初级纤毛不存在于心肌细胞中（图 1）。为进一步证实这一发现，研究者特异性敲除小鼠心肌细胞中的KIF3A（一种对初级纤毛形成至关重要的蛋白），发现仍能观察到心肌组织中有初级纤毛。接着研究者在新生大鼠和成年大鼠也检测到了初级纤毛，同样发现初级纤毛不存在于心肌细胞中（图 2）。

图1 初级纤毛存在于小鼠心脏中。（A）取1周龄和10周龄雄性C57BL/6小鼠的心脏，石蜡包埋，并用乙酰化微管蛋白（红色）和α-MHC（绿色）进行免疫染色（比例尺：20μm）。（B）是（A）的3D重建图像。（C和D）分别在小鼠胚胎期的第9.5天、10.5天、11.5天12.5天和15.5天（分别表示为E9.5、E10.5、E11.5、E12.5和E15.5）取胚胎。然后将胚胎进行石蜡包埋，用乙酰化微管蛋白（红色）和肌钙蛋白I（绿色，心肌细胞标记物）进行免疫荧光染色。细胞核用DAPI（蓝色）（100μg/mL）染色，用共聚焦显微镜收集代表性图像（n= 3）。白色箭头指示纤毛细胞的位置。RA代表右心房，LA代表左心房，LV代表左心室，RV代表右心室（比例尺：50和20μm）。

图2初级纤毛存在于大鼠心脏的成纤维细胞中。培养原代新生大鼠心脏成纤维细胞（NRCF）（A）和成年大鼠心脏成纤维细胞（ARCF）（B），并用免疫荧光法检测波形蛋白、乙酰化微管蛋白、γ-微管蛋白、PC1、PC2和KIF3A的表达（A-C）。细胞核用DAPI染色（100μg/ mL）。用共聚焦显微镜获取代表性图像（比例尺：20和5μm）。白色箭头指示γ-微管蛋白标记的纤毛的基底部。

为明确初级纤毛是否参与心肌损伤后的重塑过程及存在于何种细胞类型中，研究者在3种动物模型（心肌缺血再灌注损伤模型、心尖切除模型和心肌梗死模型）中检测了初级纤毛，并对其进行定位。在心肌缺血再灌注损伤后，梗死区富集了具有初级纤毛结构的细胞，经检测该细胞很可能是成纤维细胞（图3A-B）。

同样，在心尖切除后的伤口处具有初级纤毛结构的细胞明显增加，而该细胞并不是心肌细胞（图3C）。在心肌梗死模型同样存在具有初级纤毛结构的细胞在梗死周边区大量增加的现象，为明确细胞类型，研究者检测了巨噬细胞、内皮细胞和肌成纤维细胞（激活后的成纤维细胞），结果发现该具有初级纤毛结构的细胞是肌成纤维细胞（图3D-G）。

除了体内实验外，研究者选择成年大鼠心室肌细胞（ARVM）、新生大鼠心室肌细胞（NRVM）、成年大鼠心脏成纤维细胞（ARCF）、小鼠巨噬细胞系（RAW264.7）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及人主动脉内皮细胞（HAEC）进行了体内实验，检测初级纤毛，结果发现只有ARCF具有初级纤毛结构。

为使实验结果更具说服力，研究者收集了6名心脏移植手术患者的心肌组织进行切片染色，发现梗死周边区的形成初级纤毛结构的细胞是成纤维细胞（图3H-I）。

图3具有初级纤毛结构的细胞聚集在损伤心肌周围。取10-12周龄的小鼠行心肌缺血再灌注手术。在阻断心肌血流（I）45分钟后使血管再通（R），并于术后4天、7天和14天取材。假手术用作对照。

（A）在心脏水平方向的切片中进行Masson三色染色，评估胶原沉积变化（比例尺：1mm）。（B）通过免疫染色评估来自（A）心脏样品的纤毛细胞。乙酰化微管蛋白用作纤毛的标记物;波形蛋白用作成纤维细胞标记物。白色箭头表示纤毛（比例尺：20和5μm）。（C）对7日龄的C57BL/6小鼠行心尖切除手术。术后7天取心脏，通过免疫荧光法检测乙酰化微管蛋白评估纤毛。肌钙蛋白I用作心肌细胞标记物。（D-F）对10-12周龄雄性C57BL/6小鼠行心肌梗死手术，并于术后7天取心脏，用乙酰化的微管蛋白评估瘢痕区的纤毛。（D）α-SMA用作肌成纤维细胞标记物。（E）CD68染色用作巨噬细胞标记物，（F）CD31用作内皮细胞标记物（比例尺：20μm）。（G）D-F中显示的具有纤毛的α-SMA、CD68和CD31阳性细胞的定量统计。数据表示为平均百分比±标准误，使用单因素方差分析及Dunnet检验进行组间比较，***代表与α-SMA组相比，p<0.001(n=3-4).（H和I）人的心脏样品是在6名IV期心力衰竭患者进行心脏移植时获得的。该样品被用来进行马松三色染色（H）评估纤维化（比例尺：800μm）和免疫荧光染色（I）评估细胞的纤毛（用乙酰化微管蛋白标记）;波形蛋白用作成纤维细胞标记物（比例尺：20μm）。所有图像均用DAPI（100μg/mL）或Hoechst（1μg/mL）染细胞核，并且每组均有3-4个样本的代表性图片被拍摄。图像均用共聚焦显微镜拍摄。白色箭头代表具有纤毛结构的细胞。

鉴于心脏成纤维细胞在心肌损伤后主要发挥促心肌纤维化的作用，于是研究者猜想初级纤毛对成纤维细胞的促心肌纤维化起着关键作用。由于TGFβ1是心脏成纤维细胞发生纤维化的关键，于是研究者使用TGF-β1诱导体外成纤维细胞模拟体内纤维化过程。

使用TGF-β1处理新生大鼠成纤维细胞（NRCF）和ARCF发现TGF-β1处理后具有初级纤毛结构的细胞比例明显增加，并发现与初级纤毛传导信号相关的分子PC1和PC2、与初级纤毛形成相关的KIF3A均参与成纤维细胞初级纤毛的形成（图2C）。

成纤维细胞的分泌细胞外基质蛋白、活化、粘附、迁移和侵袭等特性均与心肌纤维化有关。为研究初级纤毛调控成纤维细胞纤维化的机制，研究者对NRCF细胞中的PC1、PC2和KIF3A分别进行敲减，随后用TGF-β1处理，发现PC1和KIF3A均促进细胞外基质蛋白纤连蛋白、胶原I和胶原III的转录，PC2却不影响，提示初级纤毛参与成纤维细胞分泌细胞外基质蛋白的过程（图4A-B,E-G）。

接下来，研究者研究了初级纤毛在成纤维细胞活化中的作用，发现在ARCF细胞中沉默IFT88（一种对纤毛功能及其形成十分重要的蛋白）可以明显减少胶原I和α-SMA（肌成纤维细胞的一种标志）的生成，在NRCF中敲除PC1可以明显减弱α-SMA的表达及细胞的收缩功能，说明初级纤毛参与成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化及后者的收缩（图4H-L）。

由于心肌损伤后的心肌纤维化还与成纤维细胞的粘附、迁移和侵袭密切相关，于是研究者对敲除了KIF3A或PC1的ARCF细胞进行TGF-β1诱导，发现初级纤毛与心肌成纤维细胞的粘附、迁移和侵袭无关。

图4初级纤毛及其功能蛋白PC1是TGF-β1诱导的心肌纤维化的必要条件。（A和B）培养NRCF，用特异性siRNA沉默PC1，PC2和KIF3A，非特异性siRNA（UNR）作为对照。然后用10ng/mLTGF-β1处理48小时，提总蛋白质或RNA。（A）用蛋白质印迹检测I型胶原、KIF3A和PC2，GAPDH作为内参。A是三个样本的代表图。B是A的定量分析。数据表示为平均值±标准误，采用双变量方差分析和Tukey检验统计组间差异。*代表p<0.05，n=3个独立的细胞培养物。（C和D）在ARCF中沉默PC1。（C）用蛋白质印迹检测用特异性靶向PC1的siRNA处理36小时后的PC1蛋白水平（FL：全长PC1，NTF：N端PC1）。（D）是C的平均光密度定量结果。数据显示为平均值±标准误，使用独立样本t检验，*表示与UNR相比p<0.05。（E-G）通过RT-qPCR法对纤连蛋白（E），胶原蛋白I（F）和胶原蛋白III（G）的转录水平进行分析，Pabpn作为内参。将结果标准化为1，将数据描述为平均值±标准误，使用双变量方差分析和Tukey检验统计组间差异（n=5-7）。*代表p< 0.05。（H和I）培养ARCF，用2种siRNA沉默IFT88，用10ng/ mLTGF-β1处理48小时后提取总蛋白。（H）蛋白质印迹检测I型胶原、α-SMA和IFT88的表达，GAPDH作为内参。（I）是H的定量结果。数据表示为平均值±标准误，采用双变量方差分析和Tukey检验进行统计分析，*代表p< 0.05；**代表p<0.01（n=3）。（J-K）分别用TGF-β1或其溶剂处理用siRNA沉默或未沉默PC1的接种在胶原基质上的NRCF细胞48小时。（J）为胶原基质收缩的代表性图片，（K）为胶原基质面积的定量统计。胶原基质面积表示为平均值±标准误，采用双变量方差分析和Tukey检验进行统计分析，*代表p<0.05（n=3）。（L）用RT-qPCR法检测α-SMA的转录水平，以18s作为内参。将结果标准化为1，并将数据表示为平均值±标准误，采用双变量方差分析和Tukey检验进行统计分析，*代表p<0.05（n= 5-7）。

在机制方面，由于SMAD蛋白是TGF-β1诱导心肌纤维化所必须的，并且初级纤毛参与TGF-β1诱导心肌纤维化，于是研究人员推测初级纤毛调节的纤维化必然也经SMAD蛋白发挥作用。于是研究人员在ARCF和NRCF中敲除KIF3A或PC1，发现TGF-β1诱导的SMAD3磷酸化水平明显降低，并观察到细胞核中的SMAD3明显减少（图5）。

图5初级纤毛及其功能蛋白PC1对TGF-β1诱导的SMAD3活化是必需的。培养NRCF（A和B）和ARCF（C和D），用10ng/ mLTGF-β1预处理30分钟，然后转染靶向于PC1或KIF3A的siRNA。（A和B）提蛋白，通过蛋白质印迹检测p-SMAD3和SMAD3。GAPDH用作内参。对条带进行定量并统计（B）。数据表示为平均值±标准误，以双因素方差分析和Tukey检验统计组间及组内差异。*代表p<0.05 （n=4）。对用或者不用TGF-β1预处理的ARCF（C）和用TGF-β1预处理随后转染PC1或KIF3A的特异性siRNA的ARCF（D）行荧光双标（酰化微管蛋白（绿色）和p-SMAD3（红色））检测。用DAPI（10ng/ mL）染细胞核，共聚焦显微镜获取代表性图像（比例尺：5μm）。

在明确初级纤毛及其功能蛋白（PC1、KIF3A等）在病理性心肌重塑过程中发挥的作用后，研究人员通过构建基因敲除小鼠初步评估了该发现的临床转化价值。研究者用到了2种肌成纤维细胞特异性敲除PC1的基因敲除小鼠，一种用TdTomato红色荧光基团对肌成纤维细胞进行示踪，一种没有。

用这两种基因敲除小鼠建立心肌梗死模型，发现敲除PC1可明显减少心肌梗死面积及可溶性胶原，促进心肌肥厚，而对模型的存活率、心功能和心肌纤维化程度无明显影响（图6、7）。

对于PC1的敲除未能改善心肌纤维化这一现象，研究者提出：由于还没有发现仅存在与心脏成纤维细胞中的基因，在试图去除心脏成纤维细胞的纤毛时选择存在于肌成纤维细胞中的骨膜素基因的启动子来驱动Cre重组酶，事实上这一策略去除的是被激活的成纤维细胞的纤毛，纤毛的去除时间存在延迟，导致在阻断纤维化之前就已经开始纤维化了。

图6成纤维细胞的PC1的特异性失活明显减少心肌梗死后心肌重构。（A）对8-12周龄雄性Pkd1f/f和Postn-Cre;PKD1f/f小鼠行心肌梗死手术，术后7天取心脏。（B）用免疫荧光双标法（PC1C端抗体标记PC1，α-SMA标记活化成纤维细胞）检测瘢痕区活化的成纤维细胞中PC1的表达（比例尺：20μm）。用DAPI（100μg/mL）染细胞核，用共聚焦显微镜获取图像（n=4）。（C）用马松三色染色检测纤维化和瘢痕大小。使用玻片扫描仪获取代表性图像，n= 12（比例尺：1mm）。（D）统计C中瘢痕大小。数据表示为平均值±标准差，使用独立样本t检验和Welch’s校正统计，n= 12。*代表p<0.05。（E）心脏重量/胫骨长度（HW/ TL）和（F）湿/干肺重量。数据表示为平均值±标准差，使用独立样本t检验和Welch’s校正统计，n=19-21。***表示p<0.001。（G）用超声心动图检测心脏缩短分数（FS），评估心室收缩功能。数据表示为平均值±标准差，使用独立样本t检验和Welch’s校正统计，n= 19-22。*代表p<0.05。（H和I）用小麦胚芽凝集素（WGA）染色评估心肌梗死后的心肌细胞横截面积（CSA）。（H）WGA染色的代表性图像。用共聚焦显微镜获取图像（比例尺20μm）。（I）为（H）的定量统计结果。数据表示为平均值±标准差，使用独立样本t检验和Welch’s校正统计，n= 10-11。*代表p<0.05。

图7特异性敲除PC1后心肌梗死诱导的心脏瘢痕成分的改变。对8-12周龄雄性Pkd1f/f和Postn-Cre;PKD1f/f小鼠行心肌梗死手术，术后7天取心脏。（A）天狼星红染色评估远端、边界和瘢痕区域的胶原沉积（比例尺：20μm)。（B-D）对A中的纤维化区域进行定量统计。（E-H）提取瘢痕中的蛋白质，通过蛋白质印迹检测纤连蛋白、胶原蛋白I和α-SMA的蛋白质水平，量化条带的灰度值并统计（F-H）。蛋白总量用作内参。（I）Sircol法测定瘢痕组织可溶性胶原水平。数据表示为平均值±标准误，采用独立样本t检验与Welch’s校正进行统计分析，每组8-10个样本。*代表p<0.05。Pkd1即为PC1的基因名。

本文首次报道了原发纤毛存在于小鼠、大鼠和人类的心脏中，特别是在心脏成纤维细胞中，心肌细胞并不存在。在心脏成纤维细胞中，原发纤毛及其关键蛋白（KIF3A和PC1）通过增加细胞外基质生成、增强细胞收缩性并激活TGF-β1-SMAD3信号轴调节心肌纤维化。该发现揭示了新的纤维化调节因子，为病理性心脏重塑的治疗提供了新的有前景的分子靶标。

文章信息：

VILLALOBOSE, CRIOLLO A, SCHIATTARELLA G G, et al. Fibroblast Primary Cilia areRequired for Cardiac Fibrosis[J]. Circulation, 2019.

标签：心脏,验证,PC1,纤维细胞,初级,纤毛,纤维化
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