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悬浮细胞、淋巴细胞培养常见失败原因及解决方案

作者:互联网

一、严格无菌操作 

对实验室以及培养过程中所接触的试剂、液体、器皿、仪器的消毒,均应严格按照有关细胞培养的参考书的要求进行操作。无菌观念要贯穿整个实验的始终,不可松懈。

 

二、培养器皿的选择 

淋巴细胞培养既可选择培养板(24 、48 、96 孔) 、培养瓶,也可选择三角烧瓶、试管等器皿进行培养。有研究表明提取的淋巴细胞用1. 5ml 离心管培养72 小时,细胞生长状况良好,细胞数与培养前比较,差异无统计学意义( P >0. 05) 。用青霉素小瓶进行培养,淋巴细胞生长也非常好。

可以认为,对散在的细胞培养来说,用小器皿具有以下优点:

(1) 便于操作:1. 5ml 离心管为一次性使用,青霉素小瓶可反复刷洗,而培养板、培养瓶价格偏贵且用过几次之后,便有些模糊不清,尤其是塑料的。更为重要的是,淋巴细胞培养为悬浮培养,在培养过程中需要不断晃动,而大多数实验室没有恒温摇床。我们发现,在培养过程中每隔6~8小时晃动一次培养器皿,便可解决这个问题。青霉素小瓶、1. 5ml 离心管晃动起来相对容易些。

(2) 减少污染:因为淋巴细胞培养的液体量较少,一般为100~ 200μl , 故文献资料中多见用培养板( 48 、96孔) ,少见用培养瓶。对分散的淋巴细胞培养,一方面一次用不了那么多孔,另一方面一旦一孔有污染,其他孔便有可能被波及,使其他孔的培养也失败。而且,晃动培养板时,很容易使液体溅到培养板盖上,增加污染的机会。而使用青霉素小瓶、1. 5ml 离心管等小器皿便可避免这些现象,但缺点是不易观察细胞生长,需取样加到载玻片上观察。

 

三、血清的选择

淋巴细胞对血清的要求较高,所以选用血清时要注意生产厂家。但胎牛血清价格昂贵,新生小牛血清或小牛血清也价格不菲,而使用自身血清不仅细胞长得好,而且更接近体内环境,避免了外来因素的干扰,使实验设计更严密。血清浓度在5 %~20 %时细胞生长比较好,当超过30 %时反而不利于细胞生长。

 

四、pH 值

细胞生长的最适pH 为7. 0~7. 2 ,可忍耐的pH 范围为6. 6~7. 8 ,当pH 低于6. 8 或大于7. 6 时, 都会抑制细胞生长 。 RPMI1640 培养基加入血清后pH 值一般升高0. 2~0.4 ,故配1640 培养液及其他用液时使pH 值达到7. 2比较合适,并且需经常检测pH 值。

 

五、培养空间

培养液与液面上的空间二者的体积比例一般以1∶10 为宜,培养液液面高度最好维持在2~5mm 的范围,以便于气体交换 。

 

六、恒温培养箱

温度应维持在37 ℃,CO2 浓度为5 % ,O2 为95 % ,100 %的饱和湿度。

 

七、常见失败原因 

1. 污染 

污染仍是细胞培养失败的主要原因,包括细菌和真菌,中药制剂尤易出现真菌污染。支原体污染不易发觉,但对细胞生长影响较小,尤其只培养72 小时。一般是分离过程中的用液和培养基出现了污染。

2. pH 值 过高或过低,或培养过程中瓶塞不紧,CO2 逸出,导致pH 值上升。

3. 诱导剂 淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,在培养过程中须添加刀豆球蛋白(ConA) 、脂多糖(LPS) 、白细胞介素2 ( IL - 2) 、植物血凝素(PHA) 、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物质。须注意它们的浓度及是否失效。

4. 培养器皿洗涤不干净 有蜡、油污或酸残留。

5. 培养用液含有杂质 配制过程中所使用的各种溶液必须用三蒸水,若含有Fe 、Ca 等离子及杂质,可影响细胞的增殖 。

6. 接种的细胞数目过多或过少,或提取的淋巴细胞中混有大量红细胞 。

7. 血清质量不佳。

8. 恒温培养箱的CO2 、温度等不稳定。

9. 存在个体差异 在相同条件下,某一受试者的血培养不成功,而对照实验培养结果正常,其原因有时无法查出.淋巴细胞的生长情况,还与受试对象的年龄有关,青年人的淋巴细胞比中、老年人的生长得要好。

解决方案:

CAR-T细胞等的体外扩增要达到临床使用数量的要求。大量的系统被使用,从简单的T型瓶到细胞培养袋再到复杂的生物反应器生产。理想的系统应具有密闭功能,减少污染的风险,因此大量的研究人员放弃了使用T型瓶。G-Rex是可伸缩的圆柱形静态培养设备,T细胞被培养在涉笔底部通气膜上,并且部分填充培养基。当细胞增殖时,用葡萄糖的消耗和乳糖产生测量培养基消耗。生长是可预期的,细胞可以用GatherRex(Wilson Wolf 生产)来收获。它是一个封闭系统设备,从培养物中提取上清。细胞通过旋转G-Rex来重新悬浮,GatheRex将悬浮和清洗的中间体收集到转移袋中,用于下游处理。

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北京泽平代理的G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶为新型底透气培养瓶,专为悬浮细胞培养设计,氧气从底部透气膜渗透进入培养体系,细胞自然沉降至培养瓶底部,葡萄糖等营养物质自然对流至细胞,乳酸等代谢废物对流至上层,被大量培养基稀释。

 

G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶独特的结构,相对传统细胞培养瓶、细胞培养板、细胞培养袋,更利于细胞生长:
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1、节省培养基:使用G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶至少节省50%培养基;
2、节省耗材:最优培养条件下,只需使用1个G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶就能收获满足需求的细胞产品;
3、减少移液操作:简单的一次性加液操作,无需补液;
4、节省培养空间:一层培养箱可放16个G-Rex100细胞培养瓶;
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【G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶产品应用】
【应用一】封闭式培养系统——符合GMP要求的CAR-T细胞培养装置

1、一次性加入培养基,培养10天,细胞扩增100倍,不需要反复换液和操作细胞;
2、静置培养,普通的培养箱即可进行;
3、培养瓶与仪器配合,以半自动方式进行细胞回收;
4、生产CAR-T细胞与传统细胞培养方法相比,表达CD62L和CD25的比例更高,抗肿瘤活性更强;
5、封闭系统,满足GMP生产要求。

使用方法:

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来源: https://blog.csdn.net/Bio12345/article/details/111629755